A Mobil Fázis

A mobil fázis a fordított fázisú kromatográfia a keverék vízzel, vagy puffer, egy poláros oldószerrel, pl. metanol, acetonitril, izopropanol (IPA), vagy tetrahydrofuran (THF). Az elúciós erő nagyjából ebben a sorrendben növekszik. Az alkoholok proton donorok, míg az acetonitril egy proton akceptor. Az acetonitril / víz keverékek kisebb viszkozitással rendelkeznek, mint a többi oldószer vízzel való keveréke. Ez alacsonyabb nyomást eredményez. Az IPA / vízkeverékek legnagyobb viszkozitással rendelkeznek. Az alacsonyabb viszkozitásból eredő alacsonyabb ellennyomás miatt a két leggyakrabban használt szerves mobilfázisú módosító az acetonitril és a metanol. Az acetonitril alacsony abszorpcióval rendelkezik az alacsony UV-ben, sokkal kisebb, mint a többi oldószer.

a víz a leggyengébb eluens a fordított fázisú kromatográfiában. A metanol vagy acetonitril hozzáadása csökkenti a retenciót. A retenciós faktor logaritmusa nagyjából a szerves oldószerkoncentrációval arányosan csökken. Ha az analit egy kis molekula, mint a legtöbb gyógyszer esetében, a retenció nagyjából hétszeresére csökken, amikor a metanol koncentrációja a mobil fázisban körülbelül 20% – kal nő. Sok esetben (pl. a módszerfejlesztés során) feltételezhető, hogy lineáris összefüggés van a retenciós tényező logaritmusa és a mozgófázisban lévő szerves módosító térfogatfrakciója között. Ezt azonban csak jó hüvelykujjszabálynak kell tekinteni, amely sem pontos, sem elméletileg nem igazolható.

az acetonitril oldódási tulajdonságai miatt a metanolhoz képest az egyik oldószer helyettesítése a másikkal gyakran megváltoztatja az analitok elúciós sorrendjét (2.ábra). Ezért ezt a technikát gyakran használják a módszerfejlesztésben. Az egyik módosítóról a másikra történő változás jelentősebb szelektivitási változásokat hoz létre ,mint önmagában az oldószer szilárdságának változása (azaz egyszerűen a szerves oldószer koncentrációjának megváltoztatásával). A THF drasztikusan megváltoztatja a szelektivitást is. Valójában a legnagyobb szelektivitási változásokat gyakran az okozza, hogy néhány metanolt vagy acetonitrilt THF-re cserélnek. Azonban több okból, mint például a kellemetlen szag, a kialakulását peroxidok, valamint a kedvezőtlen UV átláthatóság, nem használják nagyon gyakran.

2.ábra. A mobilfázisú módosító hatása az elválasztás szelektivitására. Felső, acetonitril; alsó, metanol. Oszlop: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradiens 2 ml min-1 felett 15 perc 0-80% szerves pH 3 ammónium-formiát. Analitok: 1, triamterén; 2, klórtalidon; 3, althiazid; 4, furoszemid; 5, benztiazid; 6, probenecid; 7, etakrinsav; 8, bumetanid; 9, kanrénsav. (A kromatogramot Diane Diehl és Kim Tran, Waters Corporation készítette.)

az oldószer szelektivitásának értelmezését bonyolítja az a tény, hogy a szerves oldószert az álló fázisú ligandumok adszorbeálják, és az álló fázis részének tekinthetők. Az utóbbi időben több szerző mérte a standard C18 típusú stacionárius fázisok szerves módosítóinak felületi feleslegét, és jelentős különbségeket talált az acetonitril és a metanol felületi oldásában.

e szakasz elején megemlítették, hogy a metanol nagyobb retenciót biztosít, mint az acetonitril. Ez még hangsúlyosabb az ionizált vegyületeknél, mint a nonionizált vegyületeknél. Ennek értelme abból a szempontból, hogy az adszorbeált metanol az álló fázisban megkönnyíti az ionizált molekulák behatolását az álló fázisba. Ugyanez a minta található, ha a metanolt a THF-hez hasonlítják. Ezek a módszerfejlesztés hasznos jellemzői. Másrészt a szulfonamid funkcionális csoportokkal rendelkező vegyületek viszonylag nagyobb visszatartást mutatnak a THF-ben, összehasonlítva a referenciaanalitok csoportjával. Összességében megfigyelhető a szerves oldószer jelentős hatása a szétválasztás szelektivitására, de a racionalizálás nehéz, mivel az oldószer mind a helyhez kötött, mind a mobil fázisban megtalálható. Egyes szerzők megpróbálták megkülönböztetni a magas víztartalmú mobil fázisokat az alacsony víztartalomtól.

mint már említettük, a különböző oldószerek közötti fontos szelektivitási különbségek nagyon hasznos eszköz a fordított fázisú elválasztások kialakításában. A klasszikus módszerfejlesztési rendszerek a metanolt, az acetonitrilt és a THF-et használták szerves módosítóként a mobil fázisban. Oldószerkeverékekkel közbenső szelektivitást lehet elérni, a Csúcstávolság beállítása pedig nehézség nélkül elvégezhető. A modern módszerfejlesztési rendszerek a hőmérsékletet egy másik, könnyen ellenőrizhető változóként használják a szelektivitás beállításában.

a mobilfázisú szelektivitás fontos szempontja a pH. az ionizálható vegyületek retenciójának szabályozása pufferek vagy sav vagy bázis adalékanyagok segítségével a mobil fázishoz nagyon fontos. A mobil fázisú pH körültekintően történő kiválasztásával megkönnyíthető a visszatartás és a szelektivitás manipulálása. Mint már említettük, a különbség a retenció között az ionizált és a nonionizált formában egy analit lehet 10-30-szor, és pH-szabályozás fontos.

az elmúlt években a kutatások kimutatták, hogy mind a puffer pH-ját, mind ionizációs állandóit megváltoztatják, amikor szerves oldószereket adnak hozzá. Ennek fontos következményei vannak a visszatartás ellenőrzésére. Általában az analit meghatározott ionizációjához juthatunk, ha a mobil fázis pH-ja ±2 pH-egység távolságra van az analit pKa-jától. De ha a pH és a vizsgált pKa egyaránt változik szerves oldószer hozzáadásával, akkor ezt nem könnyű egyszerű szabályok alkalmazásával kezelni. Ezért a jó pH-szabályozás és a jó puffer fontos eleme az ionizálható analitok fordított fázisú szétválasztásának reprodukálhatóságának. A pH-t vízben mérik, ahol az egyik ismeri az általánosan használt pufferek pKa-értékeit, a másik pedig inkább közel áll ezekhez a pKa-értékekhez. A maximális pufferkapacitás a puffer pKa-jában található. Míg a pH megváltozik a szerves oldószer jelenlétében,a pufferkapacitás nem. A fordított fázisú kromatográfia gyakorlója számára ez a retenciós kontroll fontos szempontja. Másrészt a fordított fázisú retenciós mechanizmusok vizsgálójának fel kell készülnie a pH mérésére a szerves oldószer jelenlétében, hogy teljes mértékben megértse annak retencióra gyakorolt hatását. A szerves oldószer hozzáadása általában a savak pKa-jának növekedését, a bázisok pKa-jának csökkenését eredményezi. Ez vonatkozik mind a pufferekre, mind az elemzőkre. Ez azt eredményezheti, hogy jelentős elmozdulás a várt ionizációs minta egy analit. Íme egy példa, amely ezt szemlélteti: a 9-es pKa-val rendelkező amin vízben pH 7-es foszfátpufferben teljesen ionizálódik, de ugyanabban a pufferben csak félig ionizálható 70% metanol hozzáadása után. Nyilvánvaló, hogy az ilyen hatások jelentősek. Ezért egy puffer előkészítésének és pH-jának szabályozásának pontos módja létfontosságú az ionizálható analitok fordított fázisú retenciójának megfelelő szabályozásához.

Egyéb Ionos kölcsönhatások befolyásolják az ionizált analitok fordított fázisú szétválasztásának retencióját és szelektivitását is. Az ionos analitok megtartásának növelésére szolgáló klasszikus eszköz az ionpár kromatográfia. Ebben a technikában a helyhez kötött fázist egy hidrofób töltésű ion, például egy hosszú láncú szulfonsav-ion (például oktilszulfonát) vagy egy hidrofób kvaterner amin (például a tetrabutilammónium ion) egyenlíti ki. Egy tipikus mobil fázis koncentráció mintegy 10 mM. Ezen ion-pár reagens, hogy a mobil fázis növeli a megtartása a cél ionokat, csökkenti a visszatartás az ionok az azonos töltésű ion-pár reagens, majd távozik a visszatartás a semleges vizsgált beleértve zwitterions szinte nem változott. Így kiváló eszköz az elválasztás szelektivitásának beállítására. A szelektivitás ezen változásainak oka az, hogy az ionpár reagens adszorbeálódik az álló fázis felületére. A kapott retenciós mechanizmus legegyszerűbb értelmezése az ioncsere kombinációja a fordított fázisú mechanizmussal. Ahogy az ionpár reagens koncentrációja a mobil fázisban nő, az ellentétes töltésű analitok visszatartása kezdetben növekszik, majd magasabb koncentrációkban lecsökken. A különböző lánchosszúságú ionpár reagensek esetében a retenció gyorsabban növekszik hosszabb lánchosszúsággal.

a kationos analitekkel tapasztalt másik ion-interakciós hatás a retenció növekedése, amikor kis szervetlen számláló ionokat adnak a mobil fázishoz. A szükséges koncentrációk általában körülbelül 10-szer magasabbak, mint az ionpár reagensekkel alkalmazott koncentrációk. Az ilyen típusú tipikus anionok a perklorát (ClO4−), a tetrafluor− borát (BF4−) vagy a hexafluor-foszfát (PF6 -). Jelentősen növelik a kationos analitok megtartását. A hatás kifejezettebb az acetonitrillel, mint a mobilfázisú adalékanyag, mint a metanollal. Ezt azzal magyarázza, hogy az álló fázisban az acetonitril vastagabb rétege adszorbeálódik a metanol monomolekuláris rétegéhez képest, és a számláló ion ebbe a rétegbe történő felosztása. A felhasználók szempontjából a kationos analitok retenciós viselkedése ezen szervetlen anionok jelenlétében nem különbözik a valódi ionpár reagensekkel, azaz hosszú láncú szulfonsavakkal megfigyelt viselkedéstől.