Single beam scanning spektrofotométer

két fő osztályok eszközök: egy sugár -, illetve kétágyas sugár. A kettős fénysugár-spektrofotométer összehasonlítja a fény intenzitását két fényút között, az egyik referencia mintát tartalmazó út, a másik pedig a vizsgálati mintát. Egynyalábú spektrofotométer méri a sugár relatív fényintenzitását a vizsgálati minta behelyezése előtt és után. Bár a kétnyalábos műszerek összehasonlító mérései könnyebbek és stabilabbak, az egynyalábos műszerek nagyobb dinamikatartományban rendelkeznek, optikailag egyszerűbbek és kompaktabbak. Ezenkívül néhány speciális műszer, például mikroszkópokra vagy teleszkópokra épített spektrofotométer, a gyakorlatiasság miatt egynyalábú műszer.

történelmileg a spektrofotométerek egy diffrakciós rácsot tartalmazó monokromátort használnak az analitikai spektrum előállításához. A rács lehet mozgatható vagy rögzített. Ha egyetlen detektort, például fotomultiplier csövet vagy fotodiódát használnak, a rácsot lépésenként (szkennelési spektrofotométer) lehet beolvasni, hogy az érzékelő minden hullámhosszon meg tudja mérni a fény intenzitását (amely megfelel az egyes “lépéseknek”). Detektorok tömbjei (tömb spektrofotométer), például töltéscsatolt eszközök (CCD) vagy fotodiód tömbök (PDA) is használhatók. Ilyen rendszerekben a rács rögzítve van, a fény minden hullámhosszának intenzitását a tömb egy másik detektorával mérik. Ezenkívül a legtöbb modern közép-infravörös spektrofotométer Fourier-transzformációs technikát alkalmaz a spektrális információk megszerzésére. Ezt a technikát Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiának nevezik.

Ha így átviteli mérések, a spektrofotométer mennyiségileg összehasonlítja a töredéke fény halad át a referencia oldat vizsgálati oldat, akkor elektronikus úton összehasonlítja az intenzitás a két jelet, majd kiszámítja a százalékos továbbítása a mintát összehasonlítva a referencia szabvánnyal. A fényvisszaverő mérések esetében a spektrofotométer kvantitatív módon összehasonlítja a referenciamintákból és a vizsgálati mintákból visszaverődő fény frakcióját. A forráslámpából származó fény egy monokromátoron halad át, amely a fényt egy forgó prizmán keresztül hullámhosszú “szivárványba” diffraktálja, és ennek a diffrakciós spektrumnak a keskeny sávszélességét a monokromator kimeneti oldalán lévő mechanikus résen keresztül adja ki. Ezeket a sávszélességeket a vizsgálati mintán keresztül továbbítják. Ezután a továbbított vagy visszavert fény fotonfluxus sűrűségét (általában négyzetméterenként watt) fotodiódával, töltéssel kapcsolt eszközzel vagy más fényérzékelővel mérik. A vizsgálati minta minden hullámhosszára vonatkozó transzmittanciát vagy reflektanciaértéket ezután összehasonlítjuk a referenciamintából származó átviteli vagy reflektanciaértékekkel. A legtöbb műszer logaritmikus függvényt alkalmaz a lineáris átviteli arányra a minta “abszorpciójának” kiszámításához, amely érték arányos a mért vegyi anyag “koncentrációjával”.

röviden, a szkennelési spektrofotométerben az események sorrendje a következő:

1. a fényforrást monokromátorra világítják, szivárványra szórják, és két gerendára osztják. Ezután a mintán és a referencia megoldásokon keresztül szkennelik be.
2. a beeső hullámhossz frakciói a mintán és a referencián keresztül, vagy onnan visszaverődnek.
3. a kapott fény a fotodetektor eszközt érinti, amely összehasonlítja a két gerenda relatív intenzitását.
4. az elektronikus áramkörök a relatív áramokat lineáris átviteli százalékokká és/vagy abszorbancia/koncentráció értékekké alakítják át.

egy tömb spektrofotométerben a sorrend a következő:

1. A fényforrás ragyogott a minta középpontjában egy rés
2. A sugárzott fény megtört a szivárvány a reflexió rács
3. A kapott fény éri a photodetector eszköz, amely összehasonlítja az intenzitás a sugár
4. Elektronikus áramkörök átalakítani a relatív áramlatok a lineáris átviteli százalékos és/vagy abszorbancia/koncentráció értékek

Sok idősebb spectrophotometers kalibrálni kell egy eljárás ismert, mint a “nullázás”, hogy egyensúlyt a null aktuális kimenet a két gerenda a detektor. A referenciaanyag továbbítását kiindulási (adat) értékként határozzák meg, így az összes többi anyag átvitelét a kezdeti “nullázott” anyaghoz viszonyítva rögzítik. A spektrofotométer ezután átalakítja az átviteli arányt “abszorpcióvá”, a vizsgálati minta specifikus összetevőinek koncentrációját a kiindulási anyaghoz képest.

Alkalmazások biochemistryEdit

Meghatározására egy fontos technika, sok biokémiai kísérletek, mely magában foglalja a DNS, RNS, fehérje izolálása, enzim kinetikai pedig biokémiai elemzések. Mivel ezekben az alkalmazásokban a minták nem állnak rendelkezésre nagy mennyiségben, különösen alkalmasak arra, hogy ebben a roncsolásmentes technikában elemezzék őket. Ezenkívül az értékes minta menthető egy mikro-térfogatú platform használatával, ahol a teljes elemzéshez mindössze 1uL minta szükséges. A spektrofotometria eljárásának rövid magyarázata magában foglalja egy olyan üres minta abszorpciójának összehasonlítását, amely nem tartalmaz színes vegyületet egy színes vegyületet tartalmazó mintához. Ez a színezés úgy valósítható meg, hogy vagy egy 595 nm-en mért Coomasie Brilliant Blue g-250 festék, vagy egy 420 nm-en mért β-galaktozidáz és ONPG (sárga minta) között látható enzimes reakció.:21-119 a spektrofotométert színes vegyületek mérésére használják a látható fényterületen (350 nm és 800 nm között),: 65 így további információt találhat a vizsgált anyagról. A biokémiai kísérletek, a kémiai és/vagy fizikai tulajdonság választott, valamint az eljárás, hogy használják az adott ingatlan annak érdekében, hogy ebből több információt a minta, mint a mennyiség, a tisztaság, az enzim aktivitás, stb. Meghatározására használható számos technikák, mint meghatározó optimális hullámhossz abszorbancia a minták, meghatározó optimális pH-az abszorbancia a minták, koncentrációk meghatározásához az ismeretlen minták, illetve meghatározza a pKa a különböző mintákat.:A 21-119-es spektrofotometria szintén hasznos folyamat a fehérjetisztításhoz, és módszerként használható egy vegyület optikai tesztjeinek létrehozására is. Spektrofotometriás adatok is használható együtt a Beer-Lambert-Egyenlet, A = − log 10 ⁡ T = ϵ c l = O D {\textstyle A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, annak érdekében, hogy meghatározzák a különböző kapcsolatok között transzmittancia, koncentráció, illetve az abszorbancia, koncentráció.:21-119 mivel egy spektrofotométer a vegyület hullámhosszát a színén keresztül méri, egy festékkötő anyagot lehet hozzáadni, hogy színváltozáson áteshessen, és megmérhető legyen. A kétkomponensű keverék koncentrációját az egyes komponensek standard oldatainak abszorpciós spektrumával lehet megismerni. Ehhez ismerni kell ennek a keveréknek a kihalási együtthatóját két hullámhosszon, valamint a két komponens ismert súlyait tartalmazó oldatok kihalási együtthatóját. A spektrofotométereket évtizedek óta fejlesztik és fejlesztik, és széles körben alkalmazzák a vegyészek körében. Ezenkívül a spektrofotométerek az UV vagy a látható fény hullámhossz abszorbancia értékeinek mérésére specializálódtak.:21-119 rendkívül pontos eszköznek tekinthető, amely szintén nagyon érzékeny, ezért rendkívül pontos, különösen a színváltozás meghatározásakor. Ez a módszer laboratóriumi kísérletekben is kényelmes, mivel ez egy olcsó, viszonylag egyszerű folyamat.