Növényi anyag

a Megfigyelések, a kémiai elemzéseket végeztek, hogy 2011-től 2018-ig a gyűjtemény a termesztett növények, a kísérleti kert az Egyetemen Louvain-la-Neuve-campus (50°39’55″N; 4°37’11″E). Virágzási időszakuk előtt és alatt (Július–Augusztus) a növényeket ellenőrzött körülmények között (24/22 °C; 16 L:8D, RH 80 ± 10%) helyezték el az egyetem növekedési kamráiban.

Rovaranyag

az A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum és B. terrestris) fő rovar látogató fajait használták a virág vonzerejének és ízlésének vizsgálatakor. A. mellifera és B. pascuorum egyedeket (tesztenként és kezelésenként 10-et) az egyetemi campus körüli vadonban (fajonként legalább négy helyen) gyűjtöttek a tesztek előtt reggel. Mint B. a terrestris egyedeket nem lehet könnyen megkülönböztetni a területen (hasonló morfológia több faj esetében), az egyetemi épületek közelében elhelyezett négy kaptárból (Biobest, Westerloo, Belgium) származó darázsokat használtunk kísérletezésre.

Virágos tulajdonságok

Pollen számít

A portok 10 virágok a férfi, mind a női fázisok gyűjtötték, jelezni, szárított forgalomba hozott egy szitán (90 µm) kell dörzsölni, hogy a pollent szemek. A pollenszemek mennyiségét lemértük. A pollenszámlálást a Lille-1 Egyetemen (Evo-Eco-Paleo egység) végezték. Egy részecskepultot használtunk, hogy megbecsüljük a pollenszemek számát ezekben a mintákban. A pollenszám előtti napon a mintákat egy csőmelegítőbe helyezték, amíg az etanol nagy része elpárolog. Ezután kényszerítettük anther dehiscence – t úgy, hogy a mintákat egy kemencébe helyezzük 56 °C-on egy éjszakán át. Minden pollenmintához 1 mL desztillált vizet adtunk hozzá. A csöveket ezután szonikálták, majd a pollenszemcséket elválasztották egymástól. A pollenoldatot (200 µL) ezután 5 mL izotóniás mérési pufferben (CASY® ton) hígítottuk. A részecskeszámláló elemzett három 400-µL mintát a pollen felfüggesztés, amely teljes részecske száma ebben az 1200 µL térfogatú, valamint számít 400 méretkategóriák kezdve 0.125 150 µm. Az üres mintákkal való összehasonlítás lehetővé tette számunkra, hogy azonosítsuk a részecskék csúcsait, amelyek mérete 20-30 µm, ami megfelel a pollenszemeknek. A pollenszemek számát antheronként úgy becsülték meg, hogy a részecskepult által megadott értékeket megszorozták a hígítási aránnyal (azaz (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

virágszín és morfológia

a virágtulajdonságokat (corolla hossz, corolla átmérő, virágszín és UV-visszaverődés) 10 virágon mértük fázisonként (10 különböző egyedtől). A sisak szélességét, a corolla hosszát és átmérőjét egy féknyereggel mérték. A tepal színtükrözési spektrumot száloptikai spektrométerrel (Avaspec-ULS2048) és xenon impulzusos fényforrással (Avalight-XE, Avantes, Apeldoorn, Hollandia) mértük. Az UV-visszaverődés méréséhez a virágokat fekete háttérre rögzítették, majd Nikon D40-nel fényképezték (part menti optikai 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

virágos Illékony gyűjtemény

illékony szerves vegyületeket (VOC – kat) vettünk fel ép hím-és női fázisú virágokból (N = 4 minden fázis esetében). Minden virágot külön-külön egy 17 mm átmérőjű nyílással ellátott (50 mm hosszú és 30 mm átmérőjű) üveghagymába helyeztünk. A levegőszennyeződés elkerülése érdekében egy aktív szénnel töltött Teflon csövet csatlakoztattak az üveg izzó egyik végéhez, és két üveg Tenax ta csövet (6 mm × 4 mm, 7 hüvelyk; 60-80 háló, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgium) csatlakoztattak a másik véghez. A Tenax csöveket kalibrált légszivattyúkhoz (Gilair plus, Sensidyn, St. Petersburg, USA) csatlakoztatták 50 mL·min−1 áramlási sebességgel 180 percig (11:00 és 14:00 óra között). A laboratóriumi körülmények 21, 5 és 23, 5 °C között mozogtak, 45-55% RH-val.

Csapdába Voc volt, akkor termikusan deszorbeálódott egy Agilent 6800 gázkromatográf ellátott Gerstel TDU thermodesorption egység CIS cryocooler tartani -50 °C után Azonnal thermodesorption, a FÁK egység T° volt programozva, a -50 °C-tól 300 °C 12 °C sec−1. A GLC készüléket egy Agilent 7975 C tömegspektrométerhez kapcsolták. Az analitikai körülmények a következők voltak:osztott módú befecskendezés (50: 1 arányban, hélium 1,6 mL min−1-ben hordozógázként), VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) oszlop (Agilent). A legjobb elválasztást lehetővé tevő hőmérsékleti programot (az előzetes vizsgálatokat nem mutatták be) a következőképpen rögzítették: 40 °C (5 perc), majd 75 °C−ra 4 °c min−1 és 115 °C (3 °C min−1), végül pedig 250 °C-ra 13 °C min-1 hőmérsékleten. A tagállamok feltételei a következők voltak: EI üzemmód 70 eV-nál, forrás T° = 250 °C, MS quadrupole 200 °C-on, és szkennelt tömegtartomány 35-500 amu.

a rögzített kromatogramokat szisztematikusan értelmezték a férfi vagy női fázisokra jellemző VOC-k keresésére. Amikor észlelték, a molekulákat számítógépes adatbázisok szerint azonosították (Wiley 250.L és PAL 600). Az azonosításokat a kereskedelemben kapható tiszta molekulák retenciós adatai alapján igazolták. A nagy tisztaságú belső standardhoz (limonén, 1 µL metanol-oldat 0-nál) viszonyítva is számszerűsítették őket.67 µg µL1 automatikusan hozzáadódik minden egyes deszorpciós csőhöz a hőkezelés előtt).

a környezeti levegőt kontrollként is gyűjtötték a háttérszennyező anyagok azonosítására. Az esetleges áttörés elkerülése érdekében szisztematikusan egy második, ugyanazzal az adszorbenssel (Tenax TA) töltött üvegpatront helyeztek el. Az elemzés nem tárt fel nyomokat az érdekes molekulákról.

Alkaloidgyűjteményt és elemzéseket

50 virágból (10 egyedből) gyűjtöttek Port, szárították, majd egy szitán (90 µm) összetörték a pollenszemek összegyűjtésére. Az alkaloidok esetében három, 15 mg pollenből álló replikációt vizsgáltak. A mintákat 2 órán át fagyasztottuk (-80 °C), majd fagyasztva szárítottuk. A száraz mintákat folyékony nitrogénnel finom porrá őrölték, és egy 1,5 mL-es mikrocentrifuga csőbe (Eppendorf, Hamburg, Németország) lemért mennyiségű port helyeztek. Az alkaloidokat 100 µL extrakciós pufferben (70% vizes metanolban és 0,5% hangyasavban) 10 percig Szövet homogenizátorral (VWR ultrahangos tisztítószerrel) extraháltuk. 12 000 fordulat / perc centrifugálás után 5 percig (centrifuga 5430 R) a felülúszót egy 1, 5 mL mikrocentrifuga csőbe helyezték át. A SpeedVac-ban történő szárítás után az alkaloidokat 200 µL LC-MS minőségű metanolban reszuszpendálták, majd 0,45 µm PTFE fecskendőszűrővel (Whatman) szűrték.

a nektárt 5 µL üveg kapilláris csövekben (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Németország) gyűjtötték össze 50 virágból (10 egyedből). Három, 15 µL nektárt tartalmazó replikátumot szárítottak SpeedVac-ban, és reszuszpendáltak 200 µL LC-MS-fokozatú metanolban, mielőtt 0,45 µm PTFE fecskendőszűrővel (Whatman) szűrték.

a kémiai analíziseket egy termo Accela szivattyúból, autosamplerből, fotodióda tömbdetektorból és egy Thermo Scientific LTQ orbitrap XL tömegdetektorból (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgium) álló LC-MS/MS rendszerrel végezték. Egy Phenomenex Gemini C18 oszlopot használtunk (2 mm × 150 mm, 3 µm részecskékkel csomagolva). Egy 300 µL min-1 áramlási sebességű bináris oldószerrendszert használtunk: a oldószer, HPLC-minőségű víz (0,1% hangyasav); valamint B oldószer, LC-MS-fokozatú metanol (0 perc: 95% A, 10-12 perc: 0% a, 13-17 perc: 95% A). 10 µL térfogatot injektáltunk, az oszlop hőmérsékletét 30 °C-on állítottuk be.a nagy felbontású MS-t pozitív üzemmódban elektrospray ionizációs forrással hajtottuk végre. A következő bemeneti feltételeket alkalmazták: kapilláris hőmérséklet, 275 °C; kapilláris feszültség, 13 V; csőlencse, 140 V; köpeny gázáram, 30 a.u.; és kiegészítő gázáramlás, 10 u.A. az adatok megszerzése és feldolgozása Xcalibur szoftverrel történt. Ez a módszer az összes alkaloid tömegtartományát lefedte (MW 329-673). A pollenből és a nektárból származó alkaloidokat nagy felbontású SM-ek segítségével fedezték fel és azonosították. Az ütközés által kiváltott disszociációval nyert fragmentáció segített az azonosításban. Az Alkaloid koncentrációkat a MeOH-ban található aconitin standard görbe alapján számították ki, és “aconitin-ekvivalens” – ként fejezték ki. Az elemzett alkaloidokat más Aconitum fajokban való jelenlétük alapján választottuk ki4, 8.

Nektártermelés és cukorösszetétel

a nektárt 5 µL üveg kapilláris csövekben (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Németország) gyűjtötték az egyetemi campus növekedési kamráiban átadott növények virágaiból (rovarlátogatás nélkül). A nektártermelési tendenciát a nap folyamán az anthesis elején becsültük meg úgy, hogy 10 óra alatt 2 óránként 12 egyedből 2 virágot mintavételeztünk. A virágonkénti teljes nektártermelést (2 virág 12 egyedből) 2 naponta mértük ugyanazon virágok esetében az egész (9 nap) virág élettartama alatt, minden nap ugyanabban az időben, 2 órával a fény bekapcsolása után. A hím és nőstény fázisok teljes termelését a hím (anthesis után 5 nappal) és a nőstény (8 nap) fázisok végén végzett mintavétel alapján becsülték meg.

Nektármintákat -80 °C-on tároltak a kémiai elemzések elvégzéséig. A származtatás után a cukor azonosítását és számszerűsítését GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD) végezte. Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df) oszlopot használtunk. Az áramlási sebesség 1,0 mL min−1 (hélium) volt. Az injektált split arányok a hexózok esetében 1/10, a szacharóz esetében 1/100 volt. A következő bemeneti feltételeket alkalmazták: sütő hőmérséklete, 105 °C 4 percig, majd 280 °C-ra 15 °C-on min-1 (20 percig), injektor hőmérséklete 250 °C.Ezután a virágonkénti nektár teljes cukortartalmát (mg) nektár térfogatának (µL) x teljes cukorkoncentrációnak (mg/µL) számították ki.

rovar viselkedés

2011-ben és 2012-ben a Dél-belgiumi fens négy fennmaradó természetes populációján végeztek vizsgálatokat. Ezek közül A “Les Abattis” természetvédelmi terület (é. sz. 49°40’50”; E. 5 ° 32 ’59”) tartalmazza a legnagyobb és legsűrűbb népességet (2970 m2, 1330 ± 1030 A. napellus flowers m-2). A “Fouches” – nél (é. sz. 49°4’8″; E. 5°43’06”), amelynek második legnagyobb népessége (1788 m2), Az a egyedei. napellus nagyon szétszórva a területen sokkal kisebb sűrűségű (176 ± 177 virágok m−2) “Chantemelle’ (49°39’37″N; 5°39’37″E)’ volt egy nem folyamatos népesség, amely három foltok (161, 423, valamint 500 m2-es), viszonylag alacsony növény, virág sűrűség (179 ± virágok 125 m−2). A “Sainte-Marie” (é.sz. 49°40’06”; é. sz. 5°32’56”) kis és foltos populációja (292 m2, 152 ± 163 m−2) egy korábbi vasúti pálya mentén mintegy 150 m-re nyúlik.

a virág látogatóit 2011-ben három egymást követő napon (augusztus 30.és szeptember 3. között), 2012-ben pedig négy napon (augusztus 21. és 27. között), száraz és meleg időjárási körülmények között 10 perces megfigyelésekben rögzítették. A hím fázisvirágok aránya ezekben a napokban és minden populációban magasabb volt, mint a nőstény fázisvirágok aránya (körülbelül 85%). Egyszerre 1 m2-en (vagy körülbelül öt növényen) belüli virágokat figyeltek meg. Populációnként legalább tíz megfigyelést végeztek (legfeljebb 16), amelyek a teljes populációban és a nap folyamán különböző időpontokban terjedtek el. Minden látogató, felvettük a fajok száma kirabolták, unrobbed virágok látogatott per növény javítás, töltött idő minden egyes virág, valamint a táplálkozási magatartás (pollen, vagy nektár gyűjtemény, törvényes vagy törvénytelen látogatás a továbbiakban rablás (alap-dolgozik, elsődleges, mind a másodlagos rabolni). 2011-ben 530, 2012-ben 400 perc alatt 183 virág látogatót regisztráltunk. Darázsfélék (B. pascuorum és B. hortorum) és mézesmadzagok (Apis mellifera) voltak a legnagyobb viráglátogatók; csak 3 B. terrestris egyedet figyeltek meg.

Pollen hordozókapacitás

fajonként harminc egyedet etil-acetáttal öltek meg, és egyenként raktározták őket. A pollent a különböző rovar testrészekből kis kockákkal zselatin-glicerin53 távolították el. A corbiculában koncentrált pollenszemcséket eltávolították, és nem szerepeltek az elemzésekben. Az összes pollenszemcsét fénymikroszkóppal számolták.

pollengyűjtés tisztasága

a természetes populációkban az A. napellus-t látogató poszméhek pollenterheléseit vettük fel. A laborban a pollenterhelést acetolizálták. 53. A 25 pollenterhelésből legalább 400 véletlenszerűen kiválasztott pollenszemcsét azonosítottak és fénymikroszkópos vizsgálattal számoltak.

követtük a ma et al.54 Az aconitin kimutatására. Amikor elkapták, az egyes méheket 3 órán át éheztették egy műanyag injekciós üvegben (7 cm hosszú, 2,8 cm belső átmérőjű) szobahőmérsékleten és teljes sötétségben a laborban. Át minden egyes méh gazdaságba cső, egy 15 mL-es centrifugacsőbe egy 4 mm-es lyukat fúrt a tipp, meg egy darab acél háló rögzített belül. Egy csepp szacharózt tartalmazó előzetes vizsgálati fázis után a vizsgálati oldatot egy 100 µL-es üveg kapilláris csőben mutattuk be, majd óvatosan összenyomtuk a csövet, hogy az oldat a cső csúcsán maradjon. Minden olyan rovarot, amely 5 perc elteltével nem volt proboscis kiterjesztés, eltávolítottuk a vizsgálatból. A vizsgálati fázisok 2 perc hosszúak voltak, az oldat térfogatát a vizsgálat előtt és után egy féknyereggel rögzítették.

a vizsgálatokat három látogató fajjal (A. mellifera, B. pascuorum és B. terrestris) végezték. Rovarfajonként tíz egyedet teszteltek minden megoldással. A szacharóz (430 µg mg-1) és az aconitin (232 µg g−1) koncentrációja megegyezett a fajunkban található koncentrációkkal. Három oldatot mutattak be: ionmentesített víz önmagában (kontroll), tiszta szacharóz oldat, szacharóz plusz aconitin oldat.

minden vizsgálat esetében minden egyes alany esetében az italválasztástól, az elfogyasztott oldat mennyiségétől, valamint a megoldással való érintkezés idejétől számított elrettentő indexet számították ki az alábbiak szerint: ID = 1 – (választás szacharózra/választás szacharózra + aconitinre) × (a szacharóz fogyasztása / a szacharóz + aconitin mennyisége) × (a szacharózoldattal való érintkezés ideje/a szacharóz + aconitin oldattal való érintkezés ideje).

statisztikai elemzések

Az adatok normalitását Shapiro–Wilk tesztekkel becsülték meg,a homoscedasticitást pedig Levene tesztjeivel igazolták. Amikor a normalitás és a homoscedasticitás követelményei teljesültek, a variancia (ANOVAs) elemzését végezték el (virágos fázishatás a virágos volatilokra). Egyébként, nemparaméteres vizsgálatokat elvégezni Wilcoxon teszt, összehasonlítás a két feltétel (virágos fázis hatása virág morfológia, valamint nektár paraméterek), valamint a Kruskall-Wallis teszt összehasonlítása több mint két feltételek (rovar, illetve megoldás hatása az elfogyasztott mennyiség, valamint a kapcsolatot időtartama a megoldás ízlelési kísérletek, rovar hatása a látogatási viselkedés), valamint a chi-négyzet vizsgálatokat végeztek, hogy hasonlítsa össze a százalékok az egyének ízlelési kísérletek. Az ANOVA és a nem parametrikus analízist több páronkénti összehasonlítás követte, amikor több mint két feltételt hasonlítottak össze. Az összes elemzést a SAS Enterprise Guide 7.1-ben végezték. Az adatokat ± szórásokként mutatjuk be.