az acsn algoritmus fogalma. A bemeneti kép méretezése a kamera képponterősségével és eltolási térképeivel történik a rögzített mintás zaj (FP) eltávolítása érdekében. Ezután a kísérleti paraméterek segítségével kiszámítjuk az OTF-határvonalat, és egy nagy áteresztő szűrt kép előállítására használjuk, amelyből a zajbecslést (NE) kapjuk. Végül ritka szűrést (SF) hajtanak végre a denoizált kép létrehozásához. b A zajváltozások összehasonlítása (szürke négyzetek) előtt és után (piros körök) zajkorrekció. Minden adatot elosztottak a tiszta Poisson zaj várható értékével. A szaggatott vonal képviseli az ideális kamera teljesítményét. Ennek a cselekménynek a létrehozásához a HeLa mikrotubulusok három különböző képkészletét használták. A hibasávok az időbeli szórást (STD) képviselik, amelyet több mint 100 kép értékelt. c, d fluktuációs térképek, azaz az STD több mint 100 sCMOS képet értékelt, amelyeket 10 ms expozíciós idő alatt szereztek meg a (C) és a (d) ACsN denoising előtt. Az intenzitást analóg-digitális egységekben (ADU) fejezik ki. e, f nagyított-a C és d fehér négyzetekkel jelölt területek képei. g a képpontok intenzitásértékeinek időbeli ingadozása, amely megfelel a körözött területeknek (1, illetve 2) e-ben, illetve f-ben. Az eredeti és a denoizált képek értékeit szürke, illetve piros színnel ábrázoljuk. Méretarányok: 500 nm (a), 1 µm (b), 3 µm (d), 300 nm (f).

mivel a rögzített minta zaj csak a kamera áramkörétől függ, a ßp és az yp egyszeri kalibrálással becsülhető meg (lásd a módszereket). Azonban gondos értékelése mind a Gauss-elosztott kijelző zaj, N(0, σR), az ingadozás miatt a Poisson-elosztott foton lövés zaj, Ép{Sp(τ)}, megszerzése szükséges pontos becslést a mögöttes jel Sp. Az értékelés elvégzéséhez kidolgoztunk egy zajmodellt, amely lehetővé teszi a zaj variancia közös becslését a mikroszkópos rendszer frekvenciaválaszának elemzésével. Ez azon a tényen alapul,hogy a Poisson eloszlása a foton lövés zaj lehet megvalósítható közelíteni egy Gauss-Eloszlás, ha a foton fluxus >3 fotonok pixel22. Különösen a Poisson variancia közelítésével bevezetett hiba, \(\sigma _p^2\), Gauss varianciával, \(\sigma _g^2\), <1% lesz, ha a fotonfluxus több mint 5 foton / pixel (kiegészítő megjegyzés 2.3). Nevezetesen, a fent említett feltételek a foton fluxus általában teljesülnek számos alkalmazás fluoreszcens mikroszkópiában23, 24. Ezért a kamerával kapcsolatos zajt két független Gauss-elosztott véletlenszerű változó összegének eredményeként tekintjük, amelynek varianciája \(\sigma _N^2 = \sigma _r^2 + \sigma _g^2\). Az ilyen eloszlás állandó teljesítményspektrális sűrűségből áll, míg a mintából érkező jelek az optikai átviteli funkcióban (OTF)25 találhatók. Ezért kihasználjuk az optikai rendszer ismereteit az OTF-en kívüli pixelingadozás értékelésére, ami csak zaj miatt következik be, majd a kapott értéket használjuk az σN eredeti képen történő levezetésére (kiegészítő megjegyzés 2.3).

ezután az algoritmus ezeket a zajstatisztikákat használja a minta önhasonlóságának nem helyi értékeléséhez, valamint a bemeneti szekvencián végzett kollaboratív, ritka szűrés elvégzéséhez. Eltérően a korábbi implementáció együttműködő szűrés, elfogadott réteges megközelítés, hogy az egymás szondák a kép önálló hasonlóság a tér-idő annak érdekében, hogy fokozza a zaj korrekció nélkül feláldozza a pontosságot, valamint a futásidejű. Röviden: A szűrő foltokban bontja le a képet, majd hasonlóságuk szerint háromdimenziós (3D) csoportokba rendezi őket.26 Ezután egy 3D átalakítást alkalmaz az egyes csoportok egyszerre történő feldolgozásához. A denoizációt Hard-thresholding végzi, és fokozza az a tény, hogy a tapaszok közötti hasonlóság miatt a 3D transzformáció az eredeti tapaszok még ritkább ábrázolását eredményezi, míg a zajteljesítmény spektruma állandó marad27. Ezt követően a denoised tapaszok visszatérnek eredeti helyükre, hogy közbenső képet alkossanak. Ezen a ponton az együttműködő szűrőt másodszor futtatják, de a kemény küszöbértéket egy Wiener szűrővel helyettesítik. A szűrőt mind a zajos, mind a közbenső képek felhasználásával végezzük, majd a végső denoizált képet generáljuk (kiegészítő 2.4.Megjegyzés). Meg kell jegyezni, hogy a zaj térbeli változása a képen befolyásolhatja a Wiener szűrő teljesítményét. Ezt azonban jelentősen enyhíti a patch-alapú feldolgozás használata, amely az egész képhez képest növeli az egyes patch-csoportok intenzitásának egységességét, nagy stabilitást mutatva a spatially variant noise9 ellen.

végül egy másik kollaboratív szűrőt hajtanak végre, amely hasonló javításokat keres a szomszédos keretekben is. Ily módon az elhúzódó zaj tovább csökkenthető, kihasználva a minta önhasonlóságát időben, miközben megőrzi az időbeli felbontásot18 (kiegészítő megjegyzés 2.5).

az ACsN

jellemzése ezután az acsn teljesítményét mind numerikus, mind kísérleti adatok felhasználásával jellemeztük. Nevezetesen, az ACsN kollaboratív szűrés a σN becslésétől, valamint az algoritmusban28 szereplő paraméterek megválasztásától függ, amelyeket mind a zajkorrekció, mind a futásidő optimalizálása érdekében választottak ki (3.1.kiegészítő megjegyzés). Megfigyeltük, hogy stratégiánk jelentősen enyhítheti a kamera zajának káros hatását, elkerülve a képfelbontás elvesztését, különösen nagy térben változó zaj jelenlétében (kiegészítő 3.2.Megjegyzés). Ezenkívül a kamerazaj a képpontértékek időbeli ingadozásait idézheti elő, amelyek nem kapcsolódnak a mintához, ezáltal befolyásolva az időeltolódás adatainak mennyiségi elemzését. Az ACsN denoising körülbelül egy nagyságrenddel csökkenti ezt a hatást, az ideális fényképezőgéphez hasonló maradék ingadozásokkal (Fig. 1b-g és 3.3. kiegészítő megjegyzés). Ezenkívül meg kell jegyezni, hogy alacsony fotonszám mellett a minta adatai összehasonlíthatóak a zajingadozásokkal, és nehezebbé válnak a visszanyerés. Így a képfelújítás teljesítménye lényegében a bemeneti kép fotonfluxusához kapcsolódik. Mindazonáltal mind a szimulációk, mind a kísérleti adatok felhasználásával ellenőriztük az acsn robusztus zajkorrekcióját gyenge fényviszonyok mellett, pixelenként 5-10 fotonra (kiegészítő 3.4. Megjegyzés).

továbbá az acsn teljesítményét a fluoreszcens mikroszkópiára általában alkalmazott különböző mintavételi arányok alapján validáltuk. A gyakorlatban a Nyquist-kritériumhoz közeli mintavételi arány jó kompromisszumot jelent a jel-zaj arány (SNR) és a részletmegőrzés között. Itt, számszerűen és kísérletileg vizsgálva a mintavételi arányok széles skáláját, megmutattuk az acsn életképességét az alacsony SNR esetében a túlmintavételezéssel, valamint a jelek észrevehető veszteségét alulmintavételezéssel (3.5. kiegészítő megjegyzés).

a természetes képektől eltérően a biológiai minták fluoreszkáló képei erősen meghatározottak, pontosan jelzett molekuláris célokat vagy struktúrákat mutatnak a sejtekben. Ezért minden fluoreszkáló kép általában a látómezőben ismétlődő konkrét objektumokat tartalmaz, amelyek elegendő nem helyi önhasonlóságot biztosítanak ahhoz, hogy az algoritmus különösen hatékony legyen a fluoreszcens mikroszkópiához. Numerikus és kísérleti adatokkal jellemeztük az ACsN teljesítmény függését a bemeneti kép önhasonlóságának használatától (kiegészítő 3.6.Megjegyzés). Továbbá, amint azt a következő, akkor számszerűen értékelni a különböző nem-biológiai, valamint a biológiai minták hogy ellenőrizze a életképességét a módszer, átívelő különböző dimenziók, morfológia, véletlenszerűség, sűrűsége, mint a kaliber célok, fluoreszcens részecskék, az egyes molekulák, mikrotubulusaival, aktin szálak, mitokondrium, filopodia, lamellipodia, valamint a kis állatok.

Szélesmező mikroszkópia

Szélesmező mikroszkópia, különösen a teljes belső reflexiós fluoreszcencia (TIRF) mikroszkópia, az egyik legszélesebb körben alkalmazott módszer a sejtképezésben29. A TIRF az üveg/víz interfészen a fény teljes belső visszaverődésének jelenségét használja annak érdekében, hogy olyan evaneszcens hullámot hozzon létre, amely csak néhány száz nanométerre terjed a fedélen. Ez lehetővé teszi a minta alján lévő fluoreszkáló címkék szelektív gerjesztését (kiegészítő ábra. 1a). Gyenge fluoreszkáló kibocsátók, gyenge fényerősség vagy rövid expozíciós idő esetén azonban az sCMOS-hoz kapcsolódó zaj súlyossá válik és rontja a képminőséget (kiegészítő ábra). 1b). Az ACsN denoising hatékonyan csökkentheti az ilyen hozzájárulásokat, és visszaszerezheti a torzítatlan jeleket a zajból, lehetővé téve a gyorsabb megszerzést anélkül, hogy veszélyeztetné az alapul szolgáló jelet (kiegészítő ábra. 1c, d).

az epi-fluoreszcencia és TIRF konfigurációkban a Szélesmező-mikroszkópia acsn denoizációját mutattuk be különböző rögzített, élő és többszínű sejtminták, köztük mikrotubulusok segítségével (1.ábra). 1 és kiegészítő ábra. 1), mitokondriumok (ábra. 2 és kiegészítő Filmek 1 és 2), és F-aktin (ábra. 2). Az ACsN használata ugyanazt a képminőséget képes fenntartani rövidebb expozíciós idővel (azaz jobb időbeli felbontással) és alacsonyabb gerjesztési szinttel (azaz kevesebb fotókárosodással). A teljesítményt tehát elsősorban a fluoreszkáló kibocsátók fotófizikája korlátozza. Kvantitatív metrikák alkalmazásával megmutattuk, hogy a módszer két nagyságrenddel alacsonyabb fotonköltségvetésű, széles mezőjű képeket képes helyreállítani a képminőség elvesztése nélkül (1.Kiegészítő táblázat).

a mitokondriumok Epi-fluoreszcens képalkotása rögzített szarvasmarha pulmonalis arteria endothel (BPAE) sejtekben 1 ms. B expozíciós idő alatt ugyanaz a kép az ACsN denoising után. C-f nagyított képek a megfelelő dobozos régiókról a-ban és b-ben. a mennyiségi eredményeket és elemzéseket az 1.Kiegészítő táblázat tartalmazza. G reprezentatív keret az élő emberi embrionális vese (HEK) sejtekben lévő mitokondriumok 100 képének időbeli elévüléséből, 50 Hz-en rögzítve (expozíciós idő: 20 ms). h az ACsN-feldolgozás után kapott képsorozat (g) megfelelő reprezentatív kerete. A G és h rovatban a szaggatott fehér mezőben megjelölt megfelelő régiók nagyított képeit jelenítik meg. I-n nagyított képek a megfelelő régiókról, amelyeket a tömör sárga mezőben g-ben jelöltek meg 200 ms (i, l), 800 ms (j, m) és 1200 ms (k, n) különböző időpontokban. o, P kétszínű kép az F-aktin (cián) és a mitokondriumok (narancs) TIRF mikroszkópiával nyert rögzített bpae sejtekben történő denoizációja előtt (o) és után (p) 2 ms expozíciós idővel. q, r keresztmetszeti intenzitási profilok (o) és (p) a megfelelő szaggatott vonal mentén o-ban, lényegesen denoizált és jobban megoldott sejtszerkezeteket mutatva. Méretarányok: 10 µm (B), 3 µm (f), 4 µm (h, p), 1 µm (h, inset) és (l).

Deconvolution and light-field microscopy

Image deconvolution is widely used in optical microscopy, from the restoration of low-quality images to the improvement of super-resolution techniques30. A zaj azonban könnyen ronthatja számos közös algoritmus teljesítményét dekonvolúciós tárgyak előállításával. Ehelyett megfigyeltük, hogy a dekonvoltált képekben az ilyen tárgyak jelentős csökkenését az Acsn denoising alkalmazásával, a Richardson–Lucy algoritmuson alapuló különböző módszerek előtt31, gépi tanulás32 és radiális ingadozás33 (kiegészítő megjegyzés 4.1). A képfelújítás javulását a globális képminőség javulása is tükrözi, amelyet olyan metrikák segítségével értékelnek, mint a Pearson-együttható (RSP)34 felbontása. Például az ACsN és a radiális fluktuáció kombinálásával szuperfelbontású képeket hoztunk létre jobb RSP értékkel, legfeljebb két nagyságrenddel nagyobb időbeli felbontással, mint a jelenleg bejelentett33 (kiegészítő ábra. 2).

A kép dekonvolúciója szintén a háromdimenziós rekonstrukció alapja a fénymikroszkópiában (LFM). Az LFM mikroszkópos rendszerben mikrolens tömböt alkalmaz, hogy mind a beeső fény kétdimenziós (2D) térbeli, mind 2D szögletes információit megkapja, lehetővé téve a minta Teljes 3D térfogatának számítógépes rekonstrukcióját egyetlen kamerakeretből35. A dekonvolúció alapú rekonstrukciós folyamat azonban rendkívül érzékeny az SNR-re, különösen az LFM szélesmező -, térfogat-és gyors képalkotó rendszerének köszönhetően. Ezért az ACsN használata a RAW képek zajának kijavítására (ábra. 3a, b) egyértelműen észrevehető javulást eredményez a 3D fénytér rekonstrukcióiban (ábra. 3c, d). Valójában a zaj jelenléte a 3D objektum hibás számításához vagy a nem fluoroforhoz kapcsolódó csúcsok terjedéséhez vezet. Az előbbi befolyásolja a mintavételt az axiális dimenzió mentén, egyenetlen axiális felbontást eredményezhet (ábra. 3e, f). Ez utóbbi további hátteret hoz létre, amely lefedi a fluoreszcencia jelet, rontva az oldalsó felbontást is (ábra. 3g-i). Az ACsN használatával mindkét hiányosság enyhíthető, ami jelentősen javítja a sejtszerkezetek 3D térfogati megjelenítését.

A, b Raw light-field images of microtubules in a HeLa cell before (A) and after (b) ACsN processing. Az inszetek a megfelelő dobozos régiók nagyított mikrolencse-képeit mutatják, ahol a zaj jelentősen csökkent, amint az a, illetve b-ből nyert háromdimenziós (3D) rekonstruált képeken látható. A mélységi információk a színskála sáv szerint vannak kódolva. Az insetek a megfelelő fehér szaggatott dobozos régiók nagyított képeit mutatják, ahol az ACsN denoising után jobb képminőség és jobb 3D felbontás figyelhető meg. e, f keresztmetszetek az YZ síkon, amelyek megfelelnek a C és d vörös szaggatott vonalaknak, ahol a mikrotubulus szerkezetek jobban megoldódnak az acsn használatával csökkentett tárgyakkal. g, h nagyított képek a vörös tömör dobozos régiókról c-ben, illetve d-ben, z = 1,4 µm-en, ahol a mikrotubulus struktúrák jobban megoldódnak az ACsN használatával. I keresztmetszeti profiljai (g, szürke) és (H, piros), amelyek megfelelnek a G, h fehér szaggatott vonalaknak. A nem fluorofórhoz kapcsolódó háttérzaj által lefedett szálakat az ACsN segítségével oldják meg. Méretarányok: 8 µm (b, d), 800 nm (B, inset), 3 µm (d, inset), 1 µm (e, g).

Egymolekula lokalizációs mikroszkópia

az ACsN megvalósíthatóságának érvényesítése érdekében az egymolekula lokalizációs mikroszkópiában (SMLM)36 A mitokondriumok VIHARKÉPEZÉSÉT hélasejtekben végeztük (kiegészítő ábra. 3). Az sCMOS-hoz kapcsolódó zaj hatása az egymolekula lokalizációjában két szempontból látható: hamis negatívok jelenléte a zaj által lefedett gyengén kibocsátó molekulák elvesztése miatt (kiegészítő ábra. 3C, d), valamint a hamis pozitívok jelenléte a forró pixelek vagy egyszerűen a zajeloszlás miatt(kiegészítő ábra. 3e, f). A nyers egymolekula adatokból származó zaj eltávolítása lehetővé teszi mindkét típusú lokalizációs hiba kiküszöbölését, ami jelentősen javította a VIHARKÉPMINŐSÉGET és a mutatókat, mint például az RSP és a felbontás skálázott hiba (RSE)34 (ábra. 4a, b). Továbbá, az ilyen jobb hatékonyság lokalizáció vezet jobb kontrasztot, valamint a megjelenése funkciók nem jól látható a rekonstrukció nélkül denoising (ábra. 4c-f). Ezenkívül a mintához nem kapcsolódó pixelingadozások csökkentése lehetővé teszi a fluoroforok villogó sebességének térképét, amely felhasználható a tökéletlen címkézés hatásainak enyhítésére (kiegészítő ábra. 4).

a mitokondriumok VIHARKÉPE rögzített HeLa cellában (RSP: 0,81, RSE: 40,6). b STORM kép rekonstruált után ACsN denoising nyers egymolekula adatok a (RSP: 0.85, RSE: 36.7). Mindkét esetben 5000 egymolekula keretet használtunk. A nyers adatok denoising előtti és utáni reprezentatív képkockáit a kiegészítő ábra mutatja. 3. A NanoJ-mókussal végzett kvantitatív képelemzés mind az RSP ( + 0.04), mind az RSE (-3.9) értékek javulását értékelte b-ben az a-hoz képest. Megfigyelhető, hogy a B lokalizációk száma az a-hoz képest növekszik, ami jobb kontrasztot eredményez az előbbiben, valamint az utóbbiban nem látható funkciók megjelenésében (c–f). g egyrészecske követés egy fluoreszkáló gyöngy rögzített egy 1 ms expozíciós idő. A betétben egy reprezentatív keret látható. Minden szín megfelel az észlelt hat különböző sáv egyikének. h ugyanazon gyöngy egyrészecskés nyomon követése g-ben az ACsN denoising (inset) után. A továbbfejlesztett SNR jobb lokalizációs pontosságot eredményez, ami egyetlen, sima pályát eredményez (fekete vonal). I reprezentatív keret a kétfedelű egyrészecske követéshez 1 kHz-es képsebességgel (expozíciós idő: 1 ms) az acsn denoising előtt (balra) és után (jobbra). Méretarányok: 4 µm( a), 2 µm (c, E, i), 1 µm (g, inset), 250 nm (h).

az egymolekula képalkotáshoz hasonlóan az egyrészecske-követés (SPT) lokalizációs pontossága szorosan kapcsolódik az észlelt fotonok számához. Ezért az SPT teljesítményét befolyásoló egyik kritikus tényező a képadatok SNR-je37. Megmutattuk, hogy az ACsN felhasználható a részecskék téves azonosításáért felelős lokalizációs hibák minimalizálására, valamint a hibás pályák (ábra. 4g, h és kiegészítő film 3). Ez az SNR-javulás jobb részecske-lokalizációs pontosságot eredményez, azaz a gyöngy oldalirányú elmozdulásának jobb becslését az al-pixel érzékenységgel. Ez nagy hasznát veheti a kétpólusú SPT-nek is, ahol a 3D-s követés pontossága a fókuszon kívüli kép minőségétől függ38 (ábra. 4i, kiegészítő Film 4, kiegészítő megjegyzés 4.2).

fluoreszcens mikroszkópia alacsony költségű CMOS kamerákkal

a közelmúltban a csúcsminőségű ipari minőségű CMOS kamerák fejlődése felkeltette a tudományos közösség érdeklődését az sCMOS kamerák teljesítményének megfizethetőbb áron történő megközelítésének lehetőségével39,40,41, 42. Kimutatták,hogy az ilyen CMOS kamerák használhatók SMLM imaging41, 42. Az alacsonyabb kvantumhatékonyság és a nagyobb leolvasási zaj azonban számos területen korlátozza a képminőséget és a kvantitatív orvosbiológiai kutatások általános használhatóságát. A kihívás megfelelő denoising stratégiával történő kezelése kritikus és időszerű megoldást jelentene az ipari minőségű kamerák szélesebb képalkotó alkalmazásokhoz való átalakítására. Itt először az acsn-t valósítottuk meg egy csúcsminőségű ipari minőségű kamerával a széles körű mikroszkópiához, mind az epi -, mind a TIRF megvilágítás használatával (ábra. 5a-h). Mindkét konfigurációban az ACsN denoising jelentősen javította a képminőséget, kiemelkedő megállapodást ért el az sCMOS fényképezőgéppel kapott képekkel (kiegészítő füge. 5 és 6, valamint a 2. Kiegészítő táblázat).

az F-aktin TIRF képe rögzített bpae cellában, 38 Hz képkockasebességgel (expozíciós idő: 26 ms). b ugyanaz a kép a után ACsN denoising. C a mitokondriumok Epi-fluoreszcencia képalkotása egy rögzített szarvasmarha – tüdőartéria endothel (BPAE)sejtben, 38 Hz-es képsebességgel (expozíciós idő: 26 ms). d ugyanaz a kép c után ACsN denoising. az e–h az a-d dobozos régióinak megfelelő nagyított képekben mutatja a képminőség javulását az ACsN denoising után. Különösen az ilyen javulás összehasonlítható az sCMOS érzékelőkkel készített képekkel, amint azt a kiegészítő füge is mutatja. 5 és 6. I, j képek a GFP-festett kalcináról élő adipocitákban (lipocitákban), alacsony költségű CMOS-val, miniatürizált mikroszkópiához az (i) előtt és után (j) ACsN denoising. Az adatokat úgy vettük fel, hogy egy miniscope-ot belemerítettünk az élő sejtkultúrába. K-n nagyított képek a megfelelő dobozos régiók i és j. o, p a celluláris struktúrák keresztmetszeti intenzitási profiljainak parcellái a (szürke) és (piros) acsn denoizációja előtt, a szaggatott vonalak mentén, k, l és m, n, sorrendben. Méretarányok: 10 µm (a, c), 4 µm (e, g), 50 µm (I), 20 µm (k).

az egy foton-gerjesztés-alapú miniatürizált mikroszkóp, vagy miniscope, úgy fejlesztették ki,hogy széles mezős kalcium képalkotást végezzen szabadon viselkedő állatokban43,44, 45. A szükséges miniatürizációt úgy sikerült elérni, hogy az összetett objektíveket egy gradiens-index (GRIN) rúdlencsével helyettesítették, amely számos előnnyel jár, beleértve az alacsony költségeket, a könnyű súlyt és a viszonylag magas numerikus rekeszértéket. A miniscope ezen tulajdonságai lehetővé teszik az agy jelentős térfogatának minimálisan invazív képalkotását sejtszintű felbontással komplex viselkedési, kognitív és érzelmi állapotok során46, 47, 48. Azonban az alacsony költségű CMOS érzékelő (MT9V032C12STM, Félvezetőn, ár ~$15) a jelenleg elfogadott gyenge képminőséget eredményez a viszonylag magas képalkotási sebesség elérése érdekében, amely súlyosan korlátozó lehet a cellás képalkotás szélesebb alkalmazásai számára. Itt validáltuk az ACsN megvalósíthatóságát a miniscope érzékelő számára azáltal, hogy egy foton-gerjesztési alapú, széles körű képalkotást végeztünk a GFP-festett kalceinről élő adipocitákban (ábra. 5i-p).

szelektív síkvilágítási mikroszkópia

a szélesmező-mikroszkópiával ellentétben a szelektív síkvilágítási mikroszkópia (SPIM) a mintát a megfigyelés irányára merőleges fénylappal megvilágítja. Ezzel elkerülhető a felesleges megvilágítás, amely lehetővé teszi a dinamikus biológiai példányok páratlan hosszú távú képalkotását. 49,50, 51. A Lattice light-sheet microscopy (LLSM) tovább optimalizálja az optikai rendszert úgy, hogy a mintát több síkhullámmal világítja meg, amelyek szaporító-invariáns optikai rácsot alkotnak.52. Míg azonban új stratégiákat vizsgálnak a mintákkal kapcsolatos kérdések kezelésére53, 54, a kamera zaj továbbra is a legfontosabb korlátozás a SPIM és az LLSM képalkotó képességekre viszonylag alacsony háttérjelük miatt.

először bebizonyítottuk, hogy az ACsN denoising képes leküzdeni ezt a korlátozást egy rögzített sós garnélarák SPIM volumetrikus vizsgálatával. Itt javítottuk az önhasonlóságot a 3D ritka szűréssel a szkennelési irány mentén. Az ACsN feldolgozás után megfigyeltük, hogy a zajszűrés minden egyes szeletnél jobban kiemeli a minta részleteit (kiegészítő ábra. 7). Különösen a rögzített mintázatú zaj korrekciója különösen észrevehető a maximális intenzitású vetítési képeken (1.ábra). 6a, e és kiegészítő film 5). Ezenkívül figyelemre méltó a beolvasott térfogat ortogonális keresztmetszeteinek egyértelmű javulása (ábra. 6b-d, f-h), amely lehetővé teszi a minta 3D struktúráinak jobb értékelését.

maximális intenzitás előrejelzések (MIP) egy fluoreszcensen jelzett felnőtt sós garnélarákról az a) pont előtt és után (e) ACsN denoising. Ortogonális nézetek a nyers (b–d) XZ síkja mentén és denoizált (f–h) térfogati vizsgálatok y = 237 mm (b, f), y = 904 mm (C, g) és y = 1491 mm (d, h). Az XY és az YZ sík mentén lévő szeleteket kiegészítő ábra tartalmazza. 7. I az LLSM-vel szerzett és az ACsN denoising segítségével feldolgozott élő emberi tüdőrákos sejtek (NCI-H1299 NSCLC) háromdimenziós renderelése. Nagyított képek az i-ben lévő fehér doboznak megfelelő területről (j) és (K) acsn denoising előtt. A megfelelő időeltolódás sorrendjét a 6.és 7. kiegészítő Filmek szolgáltatták. A MIP képeket és a reprezentatív szeleteket kiegészítő fügék ábrázolják. 9 és 10. Méretarányok: 400 µm (a, e), 100 µm (b, f), 10 µm (i), 4 µm (k).

érvényesíteni ACsN feldolgozás LLSM, először rajzolódik fix bőr sejtek festett a Keratin a EGFP különböző expozíciós idő (5, 10, 20 ms) segítségével folyamatos lézer megvilágítás ereje 27 mW (mért hátul gyújtóponti sík a megvilágítás cél). Ezeket a képeket a minta szkennelési módjával szerezték be, ennek megfelelően a szeleteket íróasztalra kellett helyezni az eredeti pozíciók lekéréséhez (lásd a módszereket). Ezt a műveletet az ACsN denoising előtt hajtottuk végre annak érdekében, hogy az önhasonlóságot A z mentén használhassuk a 3D ritka szűréshez. Megfigyeltük, hogy a képminőség jól karbantartható az expozíciós idő négyszeres csökkentése után is (kiegészítő ábra. 8. és 3. Kiegészítő táblázat).

továbbá megmutattuk az acsn kép helyreállítását a time-lapse élő cellás LLSM képalkotásban. Először élő emberi tüdőrákos sejteket (NCI-H1299 NSCLC) imagáltunk a minta szkennelési módban, 18,4 s intervallumokkal több mint 30 perc alatt (ábra. 6i-k, kiegészítő ábra. 9, és kiegészítő Filmek 6 és 7). Mint már említettük, a minta szkennelési mód megköveteli a térfogati szeletek újracsomagolását, ami növeli az adatkészlet méretét, majd a feldolgozás összetettségét. Az előző esettel ellentétben azonban a time-lapse képalkotáshoz az időbeli önhasonlóságot használtuk, ami hatékonyabb zajkorrekcióhoz vezet a volumetrikus 55-höz képest. Ezért denoizáltuk a time-lapse volumetrikus vizsgálatokat az egyes szeletek megfelelő időbeli halmazainak feldolgozásával. Ily módon az acsn-t az asztalozás előtt is fel lehet használni, hatékonyan megőrizve a denoising teljesítményt, miközben megtakarítja a számítási időt (kiegészítő ábra. 10). Ezután megfigyeltük az endogén F-aktin mozgását élő egér embrionális fibroblasztokban az LLSM használatával a lapolvasási módban (lásd a módszereket). Nevezetesen, ez a mód nem eredményez eltolódást a szeletek között, a térfogati információk pedig íróasztal nélkül is lekérdezhetők(kiegészítő ábra. 11). Különösen a filopódia mozgása a sejt körül nagyobb tisztasággal megfigyelhető a denoizálás után (8.kiegészítő film).