GDF11PRO-Fc kötődik mind GDF11, valamint MSTN

megmutatni, Hogy GDF11PRO-Fc lehet elősegíti az aktív érett GDF11 dimer keresztül közvetlen interakció, mi volt a célja, hogy azonosítsa a fehérje-fehérje kölcsönhatás GDF11, valamint GDF11PRO-Fc. A gdf11 és az MSTN szoros szerkezeti homológiája miatt azt is szerettük volna megtudni, hogy a GDF11PRO-Fc együttműködik-e az MSTN-vel. A fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosításához egy sor lehúzható vizsgálatot végeztünk (ábra. 1). Az rgdf11, az rMSTN és a rActivin a LIGANDUSOKAT HEK293 sejtekből származó lizátfrakciókkal inkubáltuk, amelyeket a GDF11PRO-Fc vagy az MPRO-Fc plazmid kódolásával transzfektáltunk a pH 7.4-nél. A módosított propeptidek konjugált Fc fragmenseinek köszönhetően a frakciókat közvetlenül egy fehérje a / G agaróz gyantára lehet húzni. Ahogy az várható volt, a GDF11PRO-Fc hatékonyan lehúzta mind az rGDF11-et, mind az rMSTN-t, jelezve, hogy a GDF11PRO-Fc képes volt mindkét ligát megkötni. Ezenkívül az MPRO-Fc sikeresen lehúzta mind az rGDF11, mind az rMSTN-t. Mind a GDF11PRO-Fc, mind az MPRO-Fc nem tudta lehúzni a távolabbi rokon TGF-β szupercsalád ligand rActivin a-t, jelezve, hogy a ligandum kötése specifikus (ábra. 1). A Gdf11pro-Fc, az MPRO-Fc, az rGDF11, az rMSTN vagy a rActivin a kötődését nem figyelték meg az a/G fehérje nélküli kontroll agaróz gyantán. Ezekből az eredményekből azt a következtetést vonjuk le,hogy a GDF11PRO-Fc spontán módon kapcsolódik az érett GDF11-hez és az mstn dimerekhez fiziológiás pH-n.

GDF11PRO-Fc társítja a GDF11-et és az MSTN-t. A gdf11pro-Fc vagy az MPRO-Fc és az rGDF11, az rMSTN vagy a rActivin a közötti fehérjefehérje-kölcsönhatásokat lehúzható vizsgálattal határozták meg. GDF11PRO-Fc vagy MPRO-Fc inkubáltuk rGDF11, rMSTN, vagy rActivin A 1 órán át 4 °C-on. Az Fc-fuzionált fehérjekomplexeket fehérje a / G-bevonatú agaróz gyantán választottuk el, az eluátumokat pedig redukáló körülmények között 12%-os SDS-oldalú gélen futtattuk, és western blot segítségével vizsgáltuk meg. A bemeneti vezérlés a bemeneti anyag 5% – a volt. WB western blot

GDF11PRO-Fc blokkok GDF11/MSTN-indukált atrófia c2c12 myotubes

az rGDF11 és az rMSTN differenciált myotubokhoz való hozzáadása korábban kimutatták, hogy a Murine c2c12-ben atrófiát vált ki, és az elsődleges emberi csontváz MYOTUBES . Miután megállapítottuk, hogy a GDF11PRO-Fc kötődik a GDF11-hez és az MSTN-hez, megkérdeztük, hogy a GDF11PRO-Fc megakadályozhatja-e a GDF11/MSTN által kiváltott myotube atrófiát differenciált c2c12 myotubes-ben. Ennek elérése érdekében a GDF11PRO-Fc DNS-szekvencia kódolását az AAV6 kapszidba csomagoltuk, hogy létrehozzuk az AAV6-GDF11PRO-Fc vektort. Ezekben a kísérletekben az aav6 vektort azért választották ki, hogy képes legyen a differenciált c2c12 myotubokat hatékonyan és szelektíven transzdukálni, de nem myoblastokat . A c2c12 myoblastokat az AAV6-GDF11PRO-Fc vagy AAV6-EGFP (kontrollvektor) kezelés előtt 5 napig tenyésztették és differenciálták 105 MOI (ábra. 2a). Ahogy az várható volt, GFP kifejezés volt megfigyelhető a C2C12 myotubes fertőzött AAV6-EGFP a 48-72 óra utáni fertőzés, valamint számszerűsítve internalized vektor genom másolat / diploid genom 72 h fertőzés utáni jelezte, hogy a vektor transzdukciós volt megfelelően érhető el (Fig. 2b és c).

GDF11PRO-Fc blokkok GDF11/MSTN-indukálta myotube atrophiát a C2C12 sejtekben. a sematikus részletező kísérleti idővonal c2c12 myotubes. Aav6-EGFP vagy AAV6-GDF11PRO-Fc került a c2c12 myotubes egy MOI 105 napon 5 utáni differenciálás és 100 ng/ml rGDF11 vagy rMSTN adunk a 7. napon. A myotubokat a 10. napon festették és elemezték. b az EGFP expresszió 48-72 h-nál nyilvánvaló volt az AAV6-EGFP-vel kezelt c2c12 myotubes-ban (MOI 10 ). A méretarány 50 µm. C vektor Genom másolatszáma diploid genomonként c2c12 myotubes 72 h-ban az AAV6-EGFP vagy AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10) hozzáadása után. D reprezentatív immunfluoreszcencia képek c2c12 myotubes. A c2c12 myotube membránokat egy anti-dystrophin antitest (piros) festésével ábrázolták. A magokat dapi (kék) festették. Az Inset nagyított régiót mutat. A méretarányok 50 µm-t (fő panel) és 25 µm-t (panelbetétet) képviselnek. e a myotubokba (differenciálódási indexbe) beépített magok frakcióját a kontroll százalékában számították ki és mutatták be. f átlagos myotube átmérő az átmérő mérésének szabályozásához és (g) eloszlásához viszonyítva. A myotube átmérőjének méréséhez minden myotube-ot a myotube hossza mentén három ponton mértek, átlagolva. h a myotube-on belül beépített magok száma. Kísérleti Állapotonként legalább 50 myotubot elemeztünk. i pSMAD2 / 3 képest tSMAD2 / 3 értékelték western blot. Az azonos fehérjeterhelést a Ponceau s festéssel igazolták, a GAPDH-t pedig terhelésszabályozóként használták. Az adatok három különálló kísérlet eredményeit képviselik. Minden hiba sáv átlag ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Hetven-két órával később, myotubes voltak rögzített festett a immunofluoreszcens elemzés segítségével egy antitest felismerve dystrophin (rod 22/rod 23), hogy szemléltesse myotube perifériás membránok, valamint DAPI folt myonuclei (Fig. 2d). A differenciálódási index csökkenését, amelyet a myotubokba beépített myonuclei arányaként határoztak meg, az rgdf11− gyel (−15%, p = 0, 0008) vagy rMSTN-vel (- 14%, p = 0, 0013) kezelt myotubokban figyelték meg a kezeletlen kontrollhoz képest. Ezt a hatást azonban a GDF11PRO-Fc-expresszáló C2C12 myotubes rgdf11-rel kezelt (−1,9%; p = 0.0047, összehasonlítva rGDF11 kezelt kontroll) vagy rMSTN (- 3,0%; p = 0,0040, összehasonlítva rMSTN kezelt kontroll; ábra. E.2. Ezenkívül az aav6-GDF11PRO-Fc-vel kezelt c2c12 myotubes ellenállt az rGDF11 vagy az rMSTN által kiváltott myotube atrófiának. Az rgdf11− gyel (−39%; 0,0002) vagy rMSTN-vel (- 35%; p = 0,0003) kezelt myotubokban a kontrollhoz viszonyított átlagos myotube átmérő jelentős csökkenését észlelték. Éppen ellenkezőleg, a gdf11pro-Fc-t kifejező myotubes rgdf11-rel kezelt (−1,8%; p = 0,0005, az rGDF11-gyel kezelt kontrollhoz képest) vagy rMSTN (−5,3%; p = 0.0075, összehasonlítva rMSTN kezelt kontroll) nagyrészt nem érintette (ábra. 2f és g). Egy külön kísérletben a GDF11PRO-Fc nem tudta megakadályozni a rActivin a-indukált myotube atrófiát, ami összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a GDF11PRO-Fc nem köti az activin a-T (további fájl 1: S3 ábra).

az rGDF11 vagy rMSTN kezelés az érett myotubok alacsonyabb arányával is társult, nagyobb számú myonucleival, ami a myotube differenciálódásának gátlására utal. A 11-nél több myotubes csak 5,2% – ot (p = 0,0215) és 7,2% – ot (p = 0.0328) az rgdf11-gyel, illetve az rMSTN-vel kezelt sejtekben elemzett myotubok. Összehasonlításképpen, a több mint 11 maggal rendelkező myotubes a myotubes 26% – át képezte a kontroll myotubes-ban. Az rGDF11-gyel vagy rMSTN-vel kezelt GDF11PRO-Fc-t kifejező myotubokban a myotubes aránya több mint 11 myonuclei-vel 22% volt (p = 0,0104, az rGDF11-gyel kezelt kontrollhoz képest), illetve 19% (p = 0,0404, az rMSTN-vel kezelt kontrollhoz képest) (ábra). 2h). Végül, az ActRII-nál a GDF11/MSTN jelátvitelt követően várható várakozásokkal összhangban, az aav6-EGFP-vel és az rGDF11-vel vagy az rMSTN-vel kezelt myotubokban a foszforilált SMAD2/3 (pSMAD2/3) fehérjeszint növekedése megfigyelhető volt a Western blot 24 h-on a ligand hozzáadása után (ábra. 2i). A pSMAD2 / 3 szintek növekedése hiányzott az AAV6-GDF11PRO-Fc-vel kezelt myotubokban, ami arra utal, hogy a GDF11PRO-Fc expresszió antagonizálja a GDF11/MSTN által kiváltott SMAD2/3 aktiválást differenciált myotubokban. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDF11PRO-Fc képes volt megakadályozni az rGDF11 és az rMSTN által kiváltott myotube atrófiát és a differenciálódás gátlását a C2C12 sejtekben.

A lokalizált GDF11PRO-Fc expresszió felnőtt egerekben a vázizom hipertrófiáját indukálja

korábban bebizonyítottuk, hogy a gdf11pro-Fc szisztémás AAV vektoros génszállítása újszülött egerekbe a vázizomnövekedés ütemének jelentős növekedéséhez vezetett . A vizsgálatból azonban nem volt világos, hogy a GDF11PRO-Fc egyszerűen növelte-e a vázizom növekedését, vagy ténylegesen kiváltotta-e a vázizom hipertrófiáját. Továbbá nem lehetett megállapítani, hogy a gdf11pro-Fc hatásait a gdf11/MSTN helyi blokádja közvetítette-e a vázizomzatban, vagy ha a megfigyelt hatások a gdf11/MSTN szisztémás modulációjának következményei. E kérdések megválaszolásához értékeljük az intramuszkuláris aav9-GDF11PRO-Fc adagolás hatását felnőtt c57bl / 6J egerekben. Ezekben a vizsgálatokban csak a jobb oldali hátsó lábat fecskendezték be, az ellenoldali bal oldali hátsó lábat pedig kontrollként használták.

a testtömeg kissé nőtt az idő múlásával az aav9-GDF11PRO-Fc-vel kezelt egerekben (+10% 10 héten; p = 0, 0418; ábra. 3a). Ezen kívül, egy-hindlimb a szorítóerőt normalizált testtömeg jelentősen nőtt mind a végtagok egyedileg vizsgált, a nagyobb mértékű a hatás a kezelt jobb oldali hindlimb (+ 37%; p = 0.0177), bár a jelentős növekedés a normalizált szorítás erőssége a kezeletlen bal oldali hindlimb (+ 18%; p = 0.0426) is megfigyelték. Ez a különbség azonban nem érte el a jelentőséget, amikor mindkét hátsó lábat egyszerre tesztelték (+15%; p = 0, 2375; ábra. 3b). Tíz héttel a vektor beadása után a jobb oldali hátsó végtag láthatóan nagyobb volt az aav9-GDF11PRO-Fc-vel kezelt egerekben (ábra. 3c). Az aav9-GDF11PRO-Fc-vel kezelt egerekben az injektált jobb oldali tibialis anterior (+ 50%; p = 0,0046) és gastrocnemius (+ 37%; p = 0,0023) nedves szöveti tömege szignifikánsan magasabb volt a járművel kezelt kontrollokhoz képest. Nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a kezeletlen bal oldali hátsó végtagok nedves szöveti tömegében (ábra. 3d). A Myofiber területelemzés kimutatta az átlagos myofiber keresztmetszeti terület növekedését (+15%; p = 0.0078) az AAV9-GDF11PRO-Fc-injektált jobb oldali gastrocnemius (ábra. 3e és f). Az MFD disztribúciós elemzés azt is kimutatta, hogy az aav9-GDF11PRO-Fc-vel befecskendezett egerek jobb oldali gastrocnemiusában a nagyobb myofiberek felé tolódik el (ábra). 3g), jelezve, hogy a lokalizált GDF11PRO-Fc expresszió izom hipertrófiát váltott ki. Egy külön kohorszban a gdf11 lokalizált génszállításának hatását az aav9-GDF11 intramuszkuláris injekciójával a jobb oldali hátsó végtagba is megvizsgáltuk, és jelentős izom atrófiát figyeltek meg a kezelés után 10 héttel az injektált hátsó végtagban (további fájl 1: S4 ábra).

GDF11PRO-Fc indukálja lokalizált vázizom hipertrófia után intramuszkuláris gén szállítás. A 8 hetes c57bl/6J egereket aav9-GDF11PRO-Fc-vel (n = 5) vagy járművel (n = 5) kezelték egyoldalú intramuszkuláris injekcióval a jobb oldali hátsó végtagba. Az ellenoldali bal oldali hátsó lábat nem kezelték. Az egereket eutanizálták 10 héttel a kezelés után. egy átlagos testtömeg idővel. b A hátsó végtag tapadási ereje a kezelést követő 10 héten belül testtömegre normalizálódott. A bemutatott mérések egyetlen hátsó végtagból és mindkét hátsó végtagból származnak. c reprezentatív bruttó hátsó végtag izomzat. Az injektált hátsó lábat fekete nyíl jelöli. d a tibialis anterior és gastrocnemius nedves szöveti tömege. e reprezentatív immunfluoreszcencia képek injektált jobb oldali gastrocnemius keresztmetszetek festett AlexaFluor-488-konjugált WGA vizualizálni myofibers. A méretarányok 100 µm-t képviselnek. f átlagos myofiber keresztmetszet a befecskendezett jobb oldali gastrocnemius területén. g Myofiber MFD Eloszlás a befecskendezett jobb oldali gastrocnemius-ban. Egérenként legalább 500 myofibert mértek. H Western blot azonosítása GDF11PRO-Fc Szövet lizátumok injektált jobb oldali gastrocnemius és májminták kezelt egerek. A gdf11pro-Fc járművel kezelt egerekben nem volt kimutatható. Az azonos fehérjeterhelést a Ponceau s festéssel igazolták, a GAPDH-t pedig terhelésszabályozóként használták. Minden hiba sáv átlag ± SEM. * p < 0, 05; **p < 0, 01; N.S. nem jelentős; összehasonlítva a járművel kezelt vezérléssel. TA tibialis anterior, Gas gastrocnemius

Western blot analysis azt mutatta, hogy a GDF11PRO-Fc fehérjét az AAV9-GDF11PRO-Fc injekcióban jobb oldali gastrocnemius (58 kDa band; ábra. 3h). A GDF11PRO-Fc azonban nem volt kimutatható a kezeletlen bal oldali gastrocnemius-ban ugyanabban a teljes fehérjemennyiségben, ami arra utal, hogy a gdf11pro-Fc vázizom többsége a befecskendezett jobb oldali hátsó végtagra lokalizálódott (az adatok nem láthatók). Gdf11pro-Fc is kimutatható volt a májban western blot jelezve, hogy néhány szisztémás expozíció történt (ábra. 3h). Ez a megfigyelés valószínűleg az aav9 vektor vaszkuláris szivárgásának tulajdonítható a szisztémás keringésbe az injekció beadásának helyéről . Ezekből az adatokból megállapítjuk, hogy a GDF11PRO-Fc felnőtt egerekben vázizom-hipertrófiát idéz elő. Ezenkívül ezeket a hatásokat legalább részben a gdf11/MSTN vázizomzatra gyakorolt helyi blokádja közvetíti, valószínűleg az ActRII-val a vázizomszövetre gyakorolt ligand kölcsönhatások gátlása révén.

Szisztémás GDF11PRO-Fc gén szállítási növeli a vázizom tömeg, erő, a mdx egerekben

a Következő értékeltük a hatása szisztémás GDF11PRO-Fc kifejezést mdx egerekben, hogy meghatározza, ha GDF11PRO-Fc is rábírja-megnagyobbodás, valamint növeli erejét disztróf harántcsíkolt izom. E vizsgálat céljából a GDF11PRO-Fc konstrukciót egy mutációval módosították, hogy áthatolhatatlanná tegye endogén BMP1 / TLD-szerű metalloproteináz hasításra (GDF11PRO-Fc D122A), és növelje a faktor perzisztenciáját a szisztémás keringésben . E kísérletek során mind az AAV9-GDF11PRO-Fc, mind az AAV9-GDF11PRO-Fc D122A-t értékelték annak megállapítására, hogy a mutált D122A transzgén in vivo kifejezettebb hatást eredményez-e. A szisztémás expresszió elérése érdekében az mdx egereket vektorral vagy járművel tail vein injekcióval kezelték. Intravénás adagolás után az aav9 vektor nagy hatékonysággal átalakítja az egérmájat. A transzdukált hepatociták ezután kifejezhetik a transzgént ,és a fehérjeterméket szisztémás keringésbe szekretálják.

az injekció beadását követő 3 héttel kezdődően a testtömeg jelentős növekedését észleltük, amely aav9-GDF11PRO-Fc (+ 7, 7% 12 héten; p = 0, 0094) és AAV9-GDF11PRO-Fc D122a (+ 11% 12 héten; p = 0, 006) kezelés (ábra. 4a). Meg kell jegyezni, hogy a dystrophiás patológia miatt az mdx egerek általában kompenzációs izom-hipertrófiát mutatnak, ami részben elfedheti a gdf11pro-Fc expresszió által kiváltott izomtömeg növekedését. Annak tekintetében, hogy az izomfunkciós tesztek, kezelt egerek mutatott megnövekedett mellső végtag markolat erejét, után is normalizálódik a testsúly. A normalizált elülső fogási szilárdság különbsége azonban csak statisztikai jelentőséggel bírt az aav9-GDF11PRO-Fc D122A csoportban. A kezelést követő 12. héten az átlagos normalizált elülső végtagfogási szilárdság + 28%-kal (p = 0, 0873) és + 36%-kal (p = 0, 0248) nőtt az aav9-GDF11PRO-Fc-vel, illetve az aav9-GDF11PRO-Fc D122A-val kezelt egerekben (ábra). 4b). Rotarod teljesítmény is javult AAV9-GDF11PRO-Fc D122A kezelés átlagosan (+93% – os növekedése rotarod késleltetési idő; p = 0,0127). A Rotarod teljesítménye szintén javult az AAV9-GDF11PRO-Fc csoportban, de ez a különbség nem érte el a statisztikai szignifikanciát (+44% – kal nőtt a rotarod késleltetési ideje; p = 0,2835; ábra. 4c). Nem volt különbség megfigyelhető futópad futási idő az egész csoportok (ábra. 4d).

GDF11PRO-Fc javítja a tapadási erőt és rotarod teljesítményt dystrophiás mdx egerekben. A 6 hetes mdx egereket aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), aav9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) vagy jármű (n = 7) a farok véna befecskendezésével kezelték. egy átlagos testtömeg idővel. b mellső végtag markolat szilárdság normalizált testtömeg idővel. c a kezelés előtti (kiindulási) és a kezelést követő 12.héten feljegyzett legjobb rotarod-esési idő. Három kísérletből a legjobb időt használták elemzésre. d a futópad teljes távolsága a kezelés előtti (kiindulási) és a kezelést követő 12.héten végzett tartóssági teszten. Minden hiba sáv átlag ± SEM. *p < 0, 05; **p < 0, 01; N.S. nem szignifikáns; összehasonlítva a járművel kezelt vezérléssel

végén a 12-heti vizsgálat, izom hipertrófia volt súlyosan nyilvánvaló a kezelt egerekben (ábra. 5a). A tibialis anterior, gastrocnemius és quadriceps átlagos nedves szöveti tömegei + 17% – kal (p = 0, 0472), + 20% – kal (p = 0, 0011) és + 14% – kal (p = 0.0333), illetve az AAV9-GDF11PRO-Fc csoportban. A AAV9-GDF11PRO-Fc D122A csoport, ezeket az értékeket tovább növelhető + 26% (p = 0.0030), + 31% (p = 0.0003), s + 23% (p = 0.0009) a jármű-kezelt kontroll a változás átlagos tibialis anterior tömeg, gastrocnemius tömeg, valamint a négyfejű tömeg, ill. Ezenkívül a membrán nedves szövet tömegét + 19%-kal (p = 0, 0162) és + 26%-kal (p = 0, 0014) növelték az AAV9-GDF11PRO-Fc, illetve az AAV9-GDF11PRO-Fc D122a csoportokban. Érdekes, hogy a szívmasszát a kezelés nem változtatta meg jelentősen. Az átlagos gastrocnemius myofiber keresztmetszeti terület magasabb volt az aav9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) és az AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+25%; p = 0,0170; ábra. 5c és d). Az MFD disztribúciós elemzésben az MFD az összes csoportban 20-30 µm körül tetőzött, ami valószínűleg a kis regeneráló myofiberek nagyobb arányának köszönhető a dystrophiás izomban. Az AAV9-GDF11PRO-Fc és az aav9-GDF11PRO-Fc D122A kezelés azonban a 64 µm-nél nagyobb MFD-kkel rendelkező myofiberek megnövekedett arányát eredményezte, ami arra utal, hogy a faktorexpresszió myofiber hipertrófiát váltott ki (ábra. 5e) a vázizomzatban.

GDF11PRO-Fc a vázizom hipertrófiáját indukálja dystrophiás mdx egerekben. A 6 hetes mdx egereket aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), aav9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) vagy jármű (n = 7) a farok véna befecskendezésével kezelték. Az egereket eutanizálták 12 héttel a kezelés után. egy reprezentatív bruttó hátsó izomzat. b a végtag izmainak, membránjának és szívének nedves szöveti tömege. c reprezentatív immunfluoreszcencia képek gastrocnemius keresztmetszetek festett AlexaFluor-488-konjugált WGA vizualizálni myofibers. A méretarányok 100 µm-t képviselnek. d átlagos myofiber keresztmetszeti terület a gastrocnemius-ban. e Myofiber MFD disztribúció a gastrocnemius-ban. Egérenként legalább 500 myofibert mértek. f A gdf11pro-Fc azonosítása western blot által az aav9-GDF11PRO-Fc-vel kezelt egerek májszöveti lizátumában és szérumában. Az egyenlő fehérjeterhelést a Ponceau s festéssel igazolták, a gapdh-t pedig a májszöveti lizátumok terhelésszabályozásaként alkalmazták. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.ok. nem jelentős; ahhoz képest, jármű-kezelt kontroll

a Western blot analízis megerősítette, fehérje kifejeződése a transgenes a máj, valamint a szérum. Ahogy az várható volt, a teljes hosszúságú GDF11PRO-Fc vagy a GDF11PRO-Fc D122a 58 kDa-nál lévő sáv kimutatható volt a kezelt egerekben. A teljes hosszúságú propeptid szérumszintje kissé magasabb volt az aav9-GDF11PRO-Fc D122A-val kezelt egereknél, mint az aav9-GDF11PRO-Fc-vel kezelt egereknél, ami arra utal, hogy az aktív propeptid szérummaradandóságát a d122a mutáció növelte (ábra). 5f).

Összességében ezek az eredmények a gdf11pro-Fc és a GDF11PRO-Fc D122a szisztémás expresszióját jelzik dystrophiás mdx egerekben, és hogy ez a vázizom hipertrófia a tapadási erő és a motoros koordináció javulásával jár együtt. Úgy tűnik azonban, hogy a kezelés nem befolyásolta az izom kitartását a futópad futási teljesítménye alapján. Ezenkívül a d122a mutáns kissé hatékonyabbnak tűnt az izomtömeg és a funkció növelésében, feltehetően a szérum perzisztencia javulása miatt.

Szisztémás GDF11PRO-Fc gén szállítás nem csökkenti a disztróf patológia mdx egerekben

számos tanulmány számolt be, hogy a blokád a TGF-β-ActRII-SMAD2/3 jelezve, hogy a MSTN gátlás vagy blokád ActRII, lehet, hogy terápiás előny az állati modellek DMD . Az AAV9-GDF11PRO-Fc kezelés dystrophiás patológiára gyakorolt hatásának meghatározásához a végtagizmok és a membrán szövettani elemzését végeztük el.

a dystrophiás patológia jellemző jelei, beleértve az izomelhalást, a központi nukleációt, az intramuszkuláris kollagén lerakódást és a gyulladásos infiltrátumok jelenlétét az összes mdx csoportban (ábra) nyilvánvalóak voltak. 6a). A gastrocnemiusban a fibrotikus terület százalékos aránya − 39%-kal (p = 0, 0273) csökkent az aav9-GDF11PRO-Fc-vel kezelt egerekben. A gastrocnemius fibrózisa szintén enyhén csökkent az AAV9-GDF11PRO-Fc D122A csoportban; azonban a végtag izom-intramuszkuláris fibrózisának nagy intersubject variabilitása miatt ez a különbség nem érte el a statisztikai szignifikanciát (−28%; p = 0, 1230; ábra. 6b). Nem volt szignifikáns különbség a központilag nukleált myofiberek arányában sem, ami arra utal, hogy a myofiber regeneráció aktívan zajlott az összes csoportban (ábra. 6c). A szérum CK, az izombontás markere szintén nem változott jelentősen a kezeléssel (ábra. 6d). Ezen túlmenően a myofiber membrán integritásának lokalizált romlása az egér IgG immunfluoreszcencia-festéssel mérve minden mdx-csoportban nyilvánvaló volt. Váratlanul az aav9-GDF11PRO-Fc D122A-val kezelt mdx egerek átlagosan enyhe növekedést mutattak az IgG-pozitív területen, de ez a különbség nem érte el a statisztikai szignifikanciát (+55%; p = 0, 1729; ábra. 6e és f; 1. kiegészítő fájl: S5 ábra). Nyilvánvaló jelei myofiber nekrózis, regeneráció, központi nukleáció, IgG penetráció nem volt nyilvánvaló a vad típusú c57bl / 10J gastrocnemius, jelezve,hogy ezek a markerek specifikusak a dystrophiás patológia (ábra. 6a-f; kiegészítő fájl 1: ábra S5).

GDF11PRO-Fc nem enyhíti az mdx egerekben a dystrophiás patológiát. A 6 hetes mdx egereket aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), aav9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) vagy jármű (n = 7) segítségével a hátsó véna injekcióval kezelték. Az életkorhoz illeszkedő c57bl/10J (n = 5) egerek vad típusú kontrollként is szerepeltek. Az egereket eutanizálták 12 héttel a kezelés után. a c57bl/10J és mdx egerek gastrocnemius keresztmetszetéből származó reprezentatív he és MTC festés. A központi nukleáció minden mdx csoportban nyilvánvaló. A myofiber nekrózis és a regeneráció lokalizált területeit fekete nyíl jelöli. A fibrotikus területet a kék régió képviseli az MTC festésen. A skála rudak HE-szakaszokban 50 µm-t, MTC-szakaszokban pedig 100 µm-t képviselnek. b fibrotikus terület a gastrocnemius-ban a teljes izom keresztmetszeti terület százalékában kifejezve. c a központi nukleációt mutató myofiberek százalékos aránya. d A szérum CK keringő szintjének mérése, az izomkárosodás markere. e reprezentatív immunfluoreszcencia képek az egér IgG festéséről (piros) a gastrocnemius Szövet keresztmetszeteiben. Az IgG pozitív festése a myofiber permeabilitását jelzi a szérumfehérjékhez és a membrán integritásának elvesztését. A szekciókat a WGA-val együtt festették, hogy megjelenítsék az egyes myofibereket. A nagyított területet fehér doboz jelöli. A jellegzetes IgG-pozitív myofibereket fehér nyíllal ábrázolják. A méretarányok 100 µm-t képviselnek. f az IgG-pozitív myofiberek területe a teljes izom keresztmetszetének százalékában kifejezve. g képviselő a c57bl/10J és mdx egerek membránkeresztmetszeteiből származó MTC festéssel. Kiterjedt patológia látható mdx, de nem c57bl / 10J egerek. A méretarányok 100 µm-t képviselnek. H fibrotikus terület a membránban a teljes keresztmetszet százalékában kifejezve. * p < 0, 05; * * * p < 0, 001; * * * p < 0, 0001; n.s. nem jelentős; ahhoz képest, vivőanyaggal kezelt mdx ellenőrzések

a rekeszizom, H&E festés kiderült, kiterjedt nekrózis, illetve intramuszkuláris kollagén lerakódás, mind a kezelt, mind a kezeletlen mdx csoport (a Fig. 6g). A gastrocnemius izomban megfigyelthez hasonlóan az aav9-GDF11PRO-Fc vagy az AAV9-GDF11PRO-Fc D122a kezelés összességében enyhe csökkenést eredményezett a membrán intramuszkuláris fibrózisában. A membránban a fibrotikus terület átlagos százalékos aránya 15% – kal (p = 0, 0328) és 17% – kal (p = 0.019) az AAV9-GDF11PRO-Fc, illetve az AAV9-GDF11PRO-Fc D122a kezeléssel (ábra. 6h). Amint az várható volt, ezek a kóros tulajdonságok nagyrészt hiányoztak a vad típusú c57bl / 10J egerek membránjában (ábra. 6g és h). Ezekből az adatokból azt állapítjuk meg, hogy a gdf11pro-Fc és a GDF11PRO-Fc D122A egy 3 hónapos időszak alatt képes enyhén gátolni a végtagizmokban és a membránban lévő intramuszkuláris kollagén lerakódást. Úgy tűnik azonban, hogy a kezelés nem állítja meg az izomdegeneráció és a regeneráció folyamatos ciklusát a felnőtt mdx egerek gastrocnemiusában vagy membránjában.