abszorpciós spektrum

a tiamin abszorpciós spektrumát a víz ellen rögzítették (1.ábra), megállapítást nyert, hogy a tiamin maximális abszorpciós csúcsot mutat (λ Max) 235nm-en. A tiamin erősen kék eltolódott λ max értéke miatt az ultraibolya abszorpciójának közvetlen mérésén alapuló dózisformában történő meghatározása érzékeny a közös segédanyagok potenciális interferenciáira. Ezért a tiamin levezetése a látható hatótávolságú elnyelő Fajok eléréséhez kétségtelenül szükséges volt. Így a tiamin NBD-Cl-vel történő származtatását elvégeztük, és a termék abszorpciós spektrumát a reagens üres anyagához rögzítettük (1.ábra). Megállapítást nyert, hogy a termék barna színű, λmax 434nm-en, az NBD-Cl λmax pedig 342NM volt. A tiamin-NBD-CL származék λmax-ja vöröseltolódott, kiküszöbölve az esetleges interferenciát. A 434 nm hullámhossz tehát optimálisan lett rögzítve.

a reakciófeltételek optimalizálása

1.ábra: tiamin (3), NBD-Cl (2) abszorpciós spektruma és a közöttük lévő komplex (1).

az optimális feltételeket A kifejlesztett módszer által megállapított változó, a paraméterek egyenként, miközben a többi paraméter állandó követően a hatást gyakorolt az abszorbancia a színes termék. A kísérleti körülmények megállapítása érdekében különböző paraméterek, például pH, idő, puffer térfogat és NBD-Cl koncentráció hatását vizsgálták.

Hatása a pH

A hatása a pH-érték a reakció között tiamin, valamint NBD-Cl teszteltük a változó pH formában 7.0 12.0. Amint az a 2. ábrán látható, a termék abszorbanciája alacsony, pH 7,0, ami azt jelzi, hogy a tiamin semleges közegben nem képes reagálni (NBD-Cl). Ez valószínűleg a tiamin aminocsoportjának hidrokloridsó formájában való létezésének köszönhető, ami gátolja a nukleofil szubsztitúciós képességet. Mivel a pH 7-ről 12-re emelkedett, a mért értékek drámaian megnövekedtek, felszabadítva a tiamin aminocsoportját, és megkönnyítve a nukleofil szubsztitúciót. A maximális felszívódást 10,5 pH-értéken érték el. A 10,5-nél nagyobb pH-értékeknél az abszorpció csökkenése következett be. Ezt valószínűleg a hidroxid-ion mennyiségének növekedésének tulajdonították, amely növeli a tiamin NBD-Cl-vel történő visszafelé reakciójának sebességét.

a reakcióidő hatása

a reakciótermék abszorbanciáját különböző időpontokban figyelték meg (3.ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy a tiamin 25°C-on reagál az NBD-Cl-vel, és az abszorbancia fokozatosan növekszik, és 25 perc elteltével eléri a maximumot. Hosszabb reakcióidők esetén az abszorbancia enyhe csökkenését figyelték meg. Ennek megfelelően az 25min-t a meghatározás kényelmes reakcióidejének állították be.

a puffer mennyiségének hatása

2.ábra: a pH hatása a tiamin reakciójára NBD-Cl-vel.
tiamin (20 µg / ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0,2% (w/v), reakcióidő 20 perc.

3.ábra: a reakcióidő hatása a tiamin reakciójára NBD-Cl-vel.
tiamin (20 µg/ml): 1 ml, puffer (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (m/v).

a pH 10, 5-nél tartása mellett a pufferoldat mennyiségének a reakciótermék abszorbanciájára gyakorolt hatását is vizsgálták(4. ábra). Az ábra azt mutatja, hogy a reakciótermék abszorbanciája gyorsan növekszik a pufferoldat mennyiségének növekedésével, és akkor válik maximálisra, ha a pufferoldat mennyisége eléri az 1,5 mL-t. Ezért az 1,5 mL pufferoldat mennyiségét a legmagasabb abszorbancia biztosítása érdekében választottuk ki.

NBD-CL koncentráció hatása

az NBD-Cl koncentrációk hatásának vizsgálata azt mutatta, hogy a reakció a reagens koncentrációjától függ. A legnagyobb abszorpciós intenzitást NBD-Cl 0,2%-os (w/v) koncentrációban érte el, és az NBD-Cl magasabb koncentrációja az abszorbencia csökkenéséhez vezet (5.ábra).

a fenti paraméter-beállító kísérletekből a vizsgálathoz használt optimalizált feltételek a következők voltak: pH 10,5, NBD-Cl koncentráció 0,2% (w/v), A puffer térfogata 1,5 mL, reakcióidő 25 perc és hőmérséklet 25ºC.

4.ábra: a Puffermennyiség (ml) hatása a tiamin NBD-Cl-vel való reakciójára.
tiamin (20µg/ml): 1 ml, puffer pH: 10,5, NBD-Cl conc. 0,2% (w/v), reakcióidő 25 perc.

5.ábra: az NBD-Cl koncentráció hatása a tiaminra adott reakciójára.
tiamin (20 µg/ml): 1 ml, puffer (pH 10,5): 1,5 ml, reakcióidő 25 perc.

a módszer validálása

a módszert a következő paraméterekre validálták: specificitás, linearitás, precizitás, pontosság, detektálási határ (LOD), mennyiségi határ (LOQ), és robusztusság a nemzetközi harmonizációs konferencia (ICH) iránymutatásai szerint .

Linearitás, kimutatási határ (LOD) a mennyiségi meghatározás határa (LOQ)

A linearitás értékelte a lineáris regressziós elemzés által meghatározott építése hét koncentrációja a tiamin, a tartományban 05–35µg/mL, ami által számított a legkevésbé tér regressziós módszerrel kell kiszámítani a kalibrációs egyenlet, a korrelációs együttható. A kalibrációs görbéket a koncentráció és az abszorbancia ábrázolásával, lineáris regressziós analízissel állítottuk össze. Az eredmények regressziós egyenlete A=0,033 x-0,009 (r2=0,999) volt, ahol A az abszorbancia 434 nm-nél, x a tiamin koncentrációja µg/mL-ben 05-35 µg/mL tartományban, r pedig korrelációs együttható (1.táblázat). Megállapítást nyert ,hogy a lineáris koncentrációtartomány összehasonlítható a korábbi NQS módszerrel. A kimutatási határértéket (lod) és a mennyiségi meghatározási határértéket (LOQ) a következő képlet szerint határoztuk meg: LOD=3.3×SDa / b, és LOQ=10×SDa/b, az SDA az intercept szórása; b az ICH irányelvek szerinti lejtés . A LOD és a LOQ értéke 0, 667, illetve 2, 020 µg/mL volt (1. táblázat).

pontosság

a javasolt módszer pontosságát 3 különböző koncentráció 10, 20 és 30 µg/mL tiamin hatóanyag alkalmazásával hajtottuk végre lineáris tartományban, a mintákból kinyert gyógyszer százalékában számítva (2. táblázat).

relatív hiba (RE) 0,24% – on belül volt, a megfelelő szórás 0,004-en belül három különböző meghatározásnál (3.táblázat).

robusztusság

reakciómechanizmus: beszámoltak arról, hogy az NBD-Cl reagál az elsődleges vagy másodlagos aminszármazékok aminocsoportjával . Hasonlóképpen, a tiamin amino csoportja nukleofilként működhet a nitrogénatomon lévő elektronok magányos párja miatt, felkapva az NBD–Cl elektronhiányos központját (4. táblázat & 6. ábra). Ugyanakkor bebizonyosodott, hogy a készítmény összetétele 1:1 tiamin és NBD-Cl (7.ábra). Tehát arra a következtetésre jutottak, hogy a tiamin aminocsoportja reagál az NBD-Cl-vel, hogy barna mellékterméket képezzen. A reakcióegyenlet a 7. ábrán látható.

6. ábra: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

A javasolt módszer alkalmazása a tiamin adagolási forma elemzésére

a tiamin tablettákat a javasolt elemzésnek vetették alá, és a címkére vonatkozó állítás jól illeszkedik az új módszerhez, amint azt az 5. táblázat mutatja. A javasolt módszer előnye, hogy gyakorlatilag mentes a segédanyagok interferenciáitól.

Figure 7: Tiamin reakció NBD-Cl mutató 1: 1 sztöchiometria.