single beam scanning spektrofotometer

Der er to hovedklasser af enheder: single beam og double beam. Et dobbeltstrålespektrofotometer sammenligner lysintensiteten mellem to lysstier, den ene sti indeholdende en referenceprøve og den anden testprøven. Et enkeltstrålespektrofotometer måler strålens relative lysintensitet før og efter, at en testprøve er indsat. Selvom sammenligningsmålinger fra dobbeltstråleinstrumenter er lettere og mere stabile, kan enkeltstråleinstrumenter have et større dynamisk interval og er optisk enklere og mere kompakte. Derudover er nogle specialiserede instrumenter, såsom spektrofotometre bygget på mikroskoper eller teleskoper, enkeltstråleinstrumenter på grund af praktisk anvendelighed.

Historisk bruger spektrofotometre en monokromator indeholdende et diffraktionsgitter til at producere det analytiske spektrum. Gitteret kan enten være bevægeligt eller fast. Hvis der anvendes en enkelt detektor, såsom et fotomultiplikatorrør eller fotodiode, kan gitteret scannes trinvist (scanningsspektrofotometer), så detektoren kan måle lysintensiteten ved hver bølgelængde (som svarer til hvert “trin”). Arrays af detektorer (array spektrofotometer), såsom ladningskoblede enheder (CCD) eller fotodiode arrays (PDA) kan også bruges. I sådanne systemer er gitteret fastgjort, og intensiteten af hver bølgelængde af lys måles af en anden detektor i arrayet. Derudover bruger de fleste moderne mid-infrarøde spektrofotometre en Fourier-transformeringsteknik til at erhverve den spektrale information. Denne teknik kaldes Fourier transform infrarød spektroskopi.

når der foretages transmissionsmålinger, sammenligner spektrofotometeret kvantitativt den brøkdel af lys, der passerer gennem en referenceopløsning og en testopløsning, sammenligner derefter elektronisk intensiteterne for de to signaler og beregner procentdelen af transmission af prøven sammenlignet med referencestandarden. Til refleksionsmålinger sammenligner spektrofotometeret kvantitativt den brøkdel af lys, der reflekteres fra reference-og testprøverne. Lys fra kildelampen føres gennem en monokromator, der diffrakterer lyset til en “regnbue” af bølgelængder gennem et roterende prisme og udsender smalle båndbredder af dette diffrakterede spektrum gennem en mekanisk slids på outputsiden af monokromatoren. Disse båndbredder transmitteres gennem testprøven. Meter kvadreret normalt) af det transmitterede eller reflekterede lys måles med en fotodiode, ladningskoblet enhed eller anden lyssensor. Transmittans-eller reflektansværdien for hver bølgelængde af testprøven sammenlignes derefter med transmissions-eller reflektansværdierne fra referenceprøven. De fleste instrumenter anvender en logaritmisk funktion på det lineære transmittansforhold for at beregne prøveens ‘absorptionsevne’, en værdi, der er proportional med ‘koncentrationen’ af det kemikalie, der måles.

kort sagt er begivenhedssekvensen i et scanningsspektrofotometer som følger:

1. lyskilden skinnes i en monokromator, diffrakteres i en regnbue og opdeles i to bjælker. Det scannes derefter gennem prøven og referenceløsningerne.
2. fraktioner af de indfaldende bølgelængder transmitteres gennem eller reflekteres fra prøven og referencen.
3. det resulterende lys rammer fotodetektorenheden, som sammenligner den relative intensitet af de to bjælker.
4. elektroniske kredsløb konverterer de relative strømme til lineære transmissionsprocenter og/eller absorbans/koncentrationsværdier.

i et array spektrofotometer er sekvensen som følger:

1. lyskilden skinnes ind i prøven og fokuseres i en spalte
2. det transmitterede lys brydes ind i en regnbue med refleksionsristen
3. det resulterende lys rammer fotodetektorenheden, der sammenligner intensiteten af strålen
4. elektroniske kredsløb konverterer de relative strømme til lineære transmissionsprocenter og/eller absorbans/koncentrationsværdier

mange ældre spektrofotometre skal kalibreres ved en procedure kendt som “nulstilling” for at balance nulstrømsudgangen for de to bjælker ved detektoren. Overførslen af et referencestof indstilles som en basisværdi (datum), så overførslen af alle andre stoffer registreres i forhold til det oprindelige “nulstillede” stof. Spektrofotometeret omdanner derefter transmissionsforholdet til’ absorptionsevne’, koncentrationen af specifikke komponenter i testprøven i forhold til det oprindelige stof.

anvendelser i biokemiredit

spektrofotometri er en vigtig teknik, der anvendes i mange biokemiske eksperimenter, der involverer DNA, RNA og proteinisolering, kinetik og biokemiske analyser. Da prøver i disse applikationer ikke er let tilgængelige i store mængder, er de især velegnede til at blive analyseret i denne ikke-destruktive teknik. Derudover kan dyrebar prøve gemmes ved at bruge en mikrovolumenplatform, hvor der kræves så lidt som 1UL prøve til komplette analyser. En kort forklaring af proceduren for spektrofotometri inkluderer sammenligning af absorptionsevnen af en tom prøve, der ikke indeholder en farvet forbindelse, med en prøve, der indeholder en farvet forbindelse. Denne farve kan opnås ved enten et farvestof, såsom Coomasie Brilliant Blue g-250 farvestof målt ved 595 nm eller ved en reaktion, der ses mellem Kurt-galactosidase og ONPG (bliver prøve gul) målt ved 420 nm.:21-119 spektrofotometeret bruges til at måle farvede forbindelser i det synlige område af lys (mellem 350 nm og 800 nm),:65 det kan således bruges til at finde mere information om det stof, der undersøges. I biokemiske eksperimenter vælges en kemisk og / eller fysisk egenskab, og den anvendte procedure er specifik for denne egenskab for at udlede mere information om prøven, såsom mængde, renhed, f.eks. Spektrofotometri kan anvendes til en række teknikker, såsom bestemmelse af optimal bølgelængdeabsorbans af prøver, bestemmelse af optimal pH for absorption af prøver, bestemmelse af koncentrationer af ukendte prøver og bestemmelse af pKa for forskellige prøver.:21-119 spektrofotometri er også en nyttig proces til proteinrensning og kan også bruges som en metode til at skabe optiske analyser af en forbindelse. Spektrofotometriske data kan også bruges sammen med Beer-Lambert − ligningen, a = -log 10 liter t = liter c L = O D {\tekststil A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, i for at bestemme forskellige relationer mellem transmittans og koncentration, og absorbans og koncentration.:21-119 da et spektrofotometer måler bølgelængden af en forbindelse gennem dens farve, kan et farvestofbindende stof tilsættes, så det kan gennemgå en farveændring og måles. Det er muligt at kende koncentrationerne af en to-komponentblanding ved hjælp af absorptionsspektrene for standardopløsningerne for hver komponent. For at gøre dette er det nødvendigt at kende udryddelseskoefficienten for denne blanding ved to bølgelængder og udryddelseskoefficienterne for opløsninger, der indeholder de kendte vægte af de to komponenter. Spektrofotometre er blevet udviklet og forbedret gennem årtier og har været meget udbredt blandt kemikere. Derudover er spektrofotometre specialiseret til at måle enten UV-eller synlige lysbølgelængdeabsorbansværdier.: 21-119 det anses for at være et meget præcist instrument, der også er meget følsomt og derfor ekstremt præcist, især ved bestemmelse af farveændring. Denne metode er også praktisk til brug i laboratorieforsøg, fordi det er en billig og relativt enkel proces.