den Mobile fase

den mobile fase i omvendt fasekromatografi er en blanding af vand eller buffer med et polært organisk opløsningsmiddel såsom methanol, acetonitril, isopropanol (IPA) eller tetrahydrofuran (THF). Elueringsstyrken øges groft i denne rækkefølge. Alkoholerne er protondonorer, mens acetonitril er en protonacceptor. Acetonitril / vandblandinger har en lavere viskositet sammenlignet med blandinger af de andre opløsningsmidler med vand. Dette resulterer i et lavere modtryk. IPA / vandblandinger har den højeste viskositet. På grund af det lavere modtryk, der skyldes den lavere viskositet, er de to mere almindeligt anvendte organiske mobilfasemodifikatorer acetonitril og methanol. Acetonitril har også en lav absorption i den lave UV, meget mindre end de andre opløsningsmidler.

vand er den svageste eluent i omvendt fasekromatografi. Tilsætningen af methanol eller acetonitril reducerer retentionen. Retentionsfaktorens logaritme falder omtrent i forhold til den organiske opløsningsmiddelkoncentration. Hvis analytten er et lille molekyle, som det er tilfældet for de fleste lægemidler, vil retentionen falde omtrent syvdoblet, når koncentrationen af methanol i den mobile fase stiger med omkring 20%. I metodeudvikling) antages det, at der er et lineært forhold mellem logaritmen for retentionsfaktoren og volumenfraktionen af den organiske modifikator i den mobile fase. Man bør dog kun betragte dette som en god tommelfingerregel, som hverken er nøjagtig eller teoretisk forsvarlig.

på grund af opløsningsegenskaberne af acetonitril sammenlignet med methanol resulterer udskiftningen af det ene opløsningsmiddel med det andet ofte i en ændring i elueringsrækkefølgen for analytterne (figur 2). Derfor anvendes denne teknik ofte i metodeudvikling. Ændringen fra en modifikator til en anden skaber mere signifikante selektivitetsændringer end ændringen af opløsningsmiddelstyrken alene (dvs.ved blot at ændre koncentrationen af det organiske opløsningsmiddel). THF ændrer også selektiviteten drastisk. Faktisk er de største selektivitetsændringer ofte forårsaget af at erstatte noget methanol eller acetonitril med THF. Af flere grunde, såsom dens ubehagelige lugt, dannelsen af peroksider og ugunstig UV-gennemsigtighed, bruges den imidlertid ikke meget ofte.

figur 2. Indflydelse af mobilfasemodifikatoren på separationens selektivitet. Top, acetonitril; bund, methanol. Kolonne: Rp18, 4,6 mm 50 mm, 3,5 liter. Gradient ved 2 ml min-1 over 15 min fra 0 til 80% organisk ved pH 3 med ammoniumformiat. Analytter: 1, triamteren; 2, chlorthalidon; 3, althiasid; 4, furosemid; 5, probenecid; 6, ethacrynsyre; 8, bumetanid; 9, canrensyre. (Kromatogram leveret af Diane Diehl og Kim Tran.)

fortolkningen af opløsningsmiddelselektivitet kompliceres af det faktum, at det organiske opløsningsmiddel adsorberes af de stationære faseligander og kan betragtes som en del af den stationære fase. For nylig har flere forfattere målt overfladeoverskuddet af de organiske modifikatorer til stationære faser af standard C18-typen og har fundet signifikante forskelle i overfladeopløsningen mellem acetonitril og methanol.

det blev nævnt i begyndelsen af dette afsnit, at methanol giver højere retention end acetonitril. Dette er endnu mere udtalt for ioniserede forbindelser end for ikke-ioniserede forbindelser. Dette giver mening ud fra det synspunkt, at den adsorberede methanol i den stationære fase letter penetrationen af de ioniserede molekyler i den stationære fase. Det samme mønster findes, når methanol sammenlignes med THF. Disse er nyttige funktioner i metodeudvikling. På den anden side viser forbindelser med sulfonamidfunktionelle grupper relativt mere retention i THF sammenlignet med en gruppe referenceanalytter. Samlet set kan en signifikant indflydelse af det organiske opløsningsmiddel på selektiviteten af en adskillelse observeres, men en rationalisering er vanskelig, da opløsningsmidlet kan findes i både den stationære og den mobile fase. Nogle forfattere har også forsøgt at skelne mobilfaser med højt vandindhold fra faser med lavt vandindhold.

som nævnt ovenfor er de vigtige selektivitetsforskelle mellem de forskellige opløsningsmidler et meget nyttigt værktøj til udvikling af reverserede faseseparationer. Klassiske metodeudviklingsordninger har brugt methanol, acetonitril og THF som de organiske modifikatorer i den mobile fase. Mellemliggende selektiviteter kan opnås med opløsningsmiddelblandinger, og en justering af spidsafstand kan udføres uden vanskeligheder. Moderne metodeudviklingsordninger bruger temperatur som en anden let kontrollerbar variabel i justeringen af selektivitet.

et vigtigt aspekt af mobilfaseselektiviteten er dens pH. kontrollen af retentionen af ioniserbare forbindelser ved hjælp af buffere eller syre-eller baseadditiver til mobilfasen er meget vigtig. Ved velovervejet valg af mobilfase-pH kan man lette manipulationen af tilbageholdelse og selektivitet. Som nævnt ovenfor kan forskellen i retention mellem den ioniserede og den ikke – ioniserede form af en analyt være 10-30 gange, og pH-kontrol er vigtig.

i de senere år har forskning vist, at både bufferens pH og ioniseringskonstanter ændres, når organiske opløsningsmidler tilsættes til det. Dette har vigtige konsekvenser for kontrollen med tilbageholdelse. Man kan normalt komme til en defineret ionisering af analytten, hvis pH-værdien i den mobile fase er kr2 pH-enheder væk fra analytens PKA. Men hvis pH og analyt pKa begge ændrer sig med tilsætning af organisk opløsningsmiddel, er det ikke let at håndtere ved hjælp af enkle regler. Derfor er en god pH-kontrol og en god buffer vigtige elementer i reproducerbarheden af en omvendt faseseparation af ioniserbare analytter. PH måles i vand, hvor man er bekendt med pKa-værdierne for de almindeligt anvendte buffere, og man foretrækker at holde sig tæt på disse pKa-værdier. Den maksimale bufferkapacitet findes ved bufferens pKa. Mens pH ændres i nærvær af det organiske opløsningsmiddel, gør bufferkapaciteten det ikke. For udøveren af omvendt fasekromatografi er dette et vigtigt aspekt af retentionskontrol. På den anden side skal efterforskeren af retentionsmekanismer med omvendt fase være forberedt på at måle pH i nærvær af det organiske opløsningsmiddel for fuldt ud at forstå dets indflydelse på retention. Tilsætningen af det organiske opløsningsmiddel resulterer typisk i en stigning i PKA af syrer og i et fald i pKa for baser. Dette gælder både buffere og analytter. Dette kan resultere i et signifikant skift i det forventede ioniseringsmønster for en analyt. Her er et eksempel, der illustrerer dette: en amin med en pKa på 9 ioniseres fuldstændigt i en phosphatbuffer ved pH 7 i vand, men den må kun halvt ioniseres i den samme buffer efter tilsætning af 70% methanol. Det er klart, at sådanne virkninger er signifikante. Derfor er en nøjagtig måde at forberede en buffer på og kontrollere dens pH afgørende for en god kontrol af den omvendte faseretention af ioniserbare analytter.

andre Ioniske interaktioner påvirker også retentionen og selektiviteten af en omvendt faseseparation af ioniserede analytter. Et klassisk værktøj til at øge tilbageholdelsen af Ioniske analytter er ionpar kromatografi. I denne teknik ækvilibreres den stationære fase med en hydrofob ladet ion, såsom en langkædet sulfonsyreion (f.eks. octylsulfonat) eller en hydrofob kvaternær Amin (f. eks. tetrabutylammoniumion). En typisk mobilfasekoncentration er omkring 10 mM. tilsætningen af ionparreagens til den mobile fase øger retentionen af målioner, nedsætter retentionen af ioner med samme ladning som ionparreagens og efterlader retentionen af neutrale analytter inklusive sekterioner næsten upåvirket. Det er således et fremragende værktøj til at justere selektiviteten af en adskillelse. Årsagen til disse ændringer i selektiviteten er det faktum, at ionparreagens adsorberes på overfladen af den stationære fase. Den enkleste fortolkning af den resulterende retentionsmekanisme er en kombination af ionbytning med den omvendte fase mekanisme. Efterhånden som koncentrationen af ionparreagensen i den mobile fase øges, øges tilbageholdelsen af modsat ladede analytter oprindeligt og niveauer derefter ved højere koncentrationer. For ion – parreagenser med forskellig kædelængde øges retentionen hurtigere med en længere kædelængde.

en anden ion-interaktionseffekt, der opstår med kationiske analytter, er stigningen i retention, når små uorganiske modioner tilsættes til den mobile fase. 10 gange højere end de koncentrationer, der anvendes med ionparreagenser. Typiske anioner af denne type er perchlorat (ClO4−), tetrafluoroborat (BF4−) eller geksafluorophosphat (PF6−). De øger tilbageholdelsen af kationiske analytter betydeligt. Effekten er mere udtalt med acetonitril som mobilfaseadditiv end med methanol. Dette forklares ved et tykkere lag af acetonitril adsorberet på den stationære fase sammenlignet med et monomolekylært lag methanol og opdelingen af modionen i dette lag. Fra brugernes synspunkt er retentionsadfærden for kationiske analytter i nærvær af disse uorganiske anioner ikke forskellig fra den, der observeres med ægte ionpar-reagenser, dvs.med langkædede sulfonsyrer.