diagnose

klinisk diagnose: klinisk billede af patienter, der lider af chlamydial infektion, kan være vildledende, da op til 70-80 procent af de inficerede kvinder og 50 procent af de inficerede mænd er asymptomatiske. Typisk vil en kvinde med ukompliceret chlamydial infektion præsentere med lugtfri, mucoid vaginal udledning uden kløe. Dysuri uden hyppighed eller uopsættelighed vil blive klaget over, hvis urinrøret er involveret. I PID kan der endvidere fremkaldes historie med svær mavesmerter med høj feber, dyspareuni, langvarige menstruationscyklusser og intermenstural blødning. Ved undersøgelse kan cervicitis med en gul, overskyet, mucoid udledning ses fra os. Livmoderhalsen har tendens til at bløde let, når den skrabes med spatel eller børste. Urinalyse vil afsløre tilstedeværelsen af > 5 VBC/HPF (høj effektfelt), hvilket tyder på urethritis13. Chlamydial infektioner kan ikke skelnes fra andre urethrale infektioner klinisk. Amin test (dvs., signifikant lugtfrigivelse ved tilsætning af KOH til vaginal sekretion) kan hjælpe med at differentiere chlamydiale infektioner fra andre infektioner i nedre kønsorganer, men har en lav specificitet.

Chlamydial infektion hos mænd manifesterer sig som urethritis hos 15-55 procent af de berørte mindre end eller lig med 35 år, lejlighedsvis kan epididymitis ses2. Mild til moderat klar til hvid urethral udledning ses om morgenen før patienten hulrum. Ved epididymitis kan historie med ensidig testikelsmerter med skrotal erytem, ømhed eller hævelse over epididymis fremkaldes. Diagnosen kan etableres ved tilstedeværelsen af mucopurulent udledning fra penis, som ved gramfarvning viser >5 VBC/HPF og fravær af intracellulære gramnegative diplokokker. Reiters syndrom kan være en sjælden komplikation af ubehandlet chlamydial infektion. En reaktiv arthritis, der inkluderer triade af urethritis / cervicitis hos kvinder, conjuntivitis og smertefri mucopurulent udbrud på håndflader og fodsåler ses i Reiters syndrom29. Kvinder er mere almindeligt påvirket end mænd. Der er asymmetriske multiple ledinvolveringer med forkærlighed for nedre ekstremiteter.

laboratoriediagnose: asymptomatisk sygdommens art og det stigende spektrum af infektioner forårsaget af C. trachomatis understrege behovet for de følsomme og pålidelige laboratoriemetoder.

færdigheder i prøveindsamling og transport er altafgørende for nøjagtighed i diagnostisk test. Både følsomheden og specificiteten af diagnostiske tests for C. trachomatis har vist sig at være direkte relateret til tilstrækkeligheden af prøven. Værtscellerne, der huser organismen, skal inkluderes i prøveopsamlingen, da chlamydiae er obligatoriske intracellulære patogener, især i teknikker, der involverer direkte visualisering af organismen.

valget af prøveudtagningssteder kan påvirke sandsynligheden for at genvinde patogenet. En stigning på 10-20 procent i genopretningen af C. trachomatis fra kønsorganerne er blevet observeret, hvis både cervikale og urethrale prøver tages i sammenligning med kun cervikal prøveudtagning42. Endocervikal vatpind, vaginal / introital vatpind, vulvalpind samt urethral og rektal vatpind og første fangst urin er de almindelige prøver taget fra de kvindelige patienter. Urethral og rektal vatpind og første fangst urinprøve kan også indsamles fra mandlige patienter ud over andre specifikke prøver som prostatavæske.

kvalitetssikring af indsamling og transport af prøven: Prøvetilstrækkelighed kan bestemmes ved visualisering af kvamo-søjleformede celler under mikroskopi. En prøve anses for tilstrækkelig, hvis den indeholder en kolonne/metaplastisk celle pr. Sandsynligheden for isolering optimeres, hvis prøven nedkøles umiddelbart efter opsamling ved 2-8 liter C. tiden mellem prøveindsamling og forarbejdning bør ideelt set være mindre end 48 timer, hvis det ikke er muligt, kan disse fryses ved -70 liter C, indtil de er forarbejdet16. Føtalt bovint serum (2-5%) bidrager til at bevare levedygtigheden af chlamydiae i prøven, som skal fryses. To-molær saccharosefosfat (2-MSP) eller saccharoseglutamatphosphat er det mest almindeligt anvendte transportmedium. Syntetiske transportmedier til kultur og nogle ikke – kulturtest er udviklet og godkendt til diagnostisk brug, dvs.M4 transportmedium, Flekstransmedium og nyt M4 syntetisk/universelt medium.

laboratoriediagnosen af Chlamydia består af følgende metoder:

(i) specifikke tests

cellekultur: isolering af organismen er den endelige metode til diagnose af chlamydial infektion. Klamydia er et obligatorisk intracellulært patogen og kræver derfor embryonerede hønsæg eller dyrecellelinjer til kultur. Sådanne dyrkningsmetoder er teknisk vanskelige, arbejdskrævende, besværlige og dyre og er ikke blevet bredt vedtaget som en rutinemæssig test udført i generelle kliniske laboratorier. Imidlertid, tre In vitro-systemer er blevet anvendt til kultur af chlamydiae nemlig. inokulation af mus (intraperitoneal, intrakraniel og intravenøs), inokulation af blommesækken (7-8 dage gammel kyllingembryo-inokulation af blommesækken) og cellekulturlinjer16. De mest almindeligt anvendte cellelinjer omfatter-HeLa 229 celler, McCoy celler, BHK21 og bgmk celler24.

cellekulturens følsomhed over for isolering af chlamydiae forstærkes ved forbehandling af celler ved polykationer, DEAE-dekstraner, centrifugering af inokulumet på cellemonolaget og inkorporering af antimetabolitter såsom cycloheksid eller cytochalasin B i cellekulturmediet 42. Cellemonolag til kultur af C. trachomatis dyrkes i tromle-eller skalhætteglas på glasovertræk eller i brøndene i multicellekulturskåle. Shell-hætteglasmetoden er mere følsom for klinisk prøve end multicellekultur på grund af mindre chancer for krydskontaminering42. Før podning skal prøven sonikeres for at forstyrre værtscellerne og for at adskille chlamydiale indeslutninger. For at inokulere cellekulturerne skal det overliggende kulturmedium fjernes og erstattes med nok prøve i kulturtransportmediet til at dække monolaget og forhindre tørring.

det mest anvendte vækstmedium er Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) suppleret med aminosyrer og vitaminer, føtalt kalveserum (5-10), ekstra glukose (0,056 m) og 2-glutamin42. Efter podning inkuberes kulturerne ved 37o C i 2-3 dage. De chlamydiale indeslutninger observeres derefter ved immunofluorescerende farvning. Isolationens følsomhed har vist sig at variere fra 70-85 procent afhængigt af laboratoriet og det anvendte kultursystem. Traditionelt er dette” guldstandarden ” til diagnosticering af C. trachomatis, da den er 100 procent specifik42. Desværre er det uden for de fleste private og offentlige laboratoriers kapacitet på grund af dets tekniske efterspørgsel, arbejdskraftintensitet og høje omkostninger.

Direkte fluorescerende test (DFA): Dfa-testen tilføjer den betydelige fordel ved Klamydiaspecifik antistoffarvning til direkte undersøgelse af prøven og forbliver en af de mest nyttige diagnostiske teknikker. I denne test anvendes hurtig identifikation af elementære legemer i udstrygninger med flourescein isothiocynat – konjugerede monoklonale antistoffer (FITC-Mab) mod MOMP eller slægtsspecifikke lp ‘ er. Elementære legemer fremstår som forskellige, skarpt skitserede, æblegrønne, skiveformede (300 nm) partikler og retikulære legemer forekommer omkring tre gange større end elementære legemer med en fluorescerende halo.

denne procedure kræver ikke strenge betingelser for prøvetransport, da en bedside smear fremstilles og efterfølgende transporteres til forarbejdning. Ved brug af MOMP af C. trachomatis er følsomheden og specificiteten af DFA fundet at være henholdsvis 80-90 procent og 98-99 procent i forhold til kultur43. DFA ‘ s høje specificitet skyldes dets afhængighed af visualiseringen af karakteristiske morfologi og farvningsegenskaber ved chlamydiale indeslutninger. DFA er den eneste tilgængelige diagnostiske test, der tillader samtidig vurdering af prøvetilstrækkelighed ved visualisering af epitelceller, der er til stede i udstrygningen. 30 min), men mikroskopisk undersøgelse og fortolkning af resultater kræver ekspertise. Denne metode anbefales derfor til laboratorier med lavt volumen. Denne test kan også anvendes på ekstragenitale steder. Det rapporteres at være mere følsomt end kultur til påvisning af klamydia i endometrie-eller tubalprøve42.

ELISA (immunosorbantassay): ELISA er tilgængelig til påvisning af C. trachomatis antigen. Flere kommercielt tilgængelige ELISA-sæt er tilgængelige til formålet. De fleste af disse opdager chlamydial LPS, som er mere opløselig end MOMP. Immunoassay-test (VVM) er rapporteret at have en følsomhed på 62-96 procent og en specificitet på 86-99 procent sammenlignet med cellekultur44. Denne test er velegnet til laboratorier uden adgang til cellekultur. Imidlertid har forskellige store og små undersøgelser over hele verden,herunder Indien,rapporteret om dårlig følsomhed af ELISA sammenlignet med DFA og PCR45, 46, 47.

cytologi: cytologi er en let tilgængelig, enkel at bruge og omkostningseffektiv diagnostisk test. Det kræver ikke forholdsregler for opbevaring og transport af prøver, og ikke-levedygtige/ikke-infektiøse partikler kan også påvises. Kvaliteten af den kliniske prøve kan vurderes ved hjælp af den mikroskopiske teknik, og de tekniske procedurer, der anvendes i disse tests, er normalt hurtigere og enklere at udføre end kultur. Giemsa, immunoflourescence og jod farvning metoder er mest almindeligt anvendt. Andre pletter som immunoperoksidase, immunoferritin, kan også bruges til at detektere chlamydial inklusion i eksfolierede celler. Tilstedeværelsen af intracytoplasmatiske indeslutninger er patogenonomisk for chlamydiale okulære infektioner hos nyfødte, men denne metode anbefales ikke til diagnosticering af konjunktivitis eller kønsinfektion hos voksne på grund af manglende følsomhed. Af de tre metoder tilbyder immunofluorescens den højeste følsomhed efterfulgt af Giemsa og derefter jodfarvning42.

molekylære metoder: De traditionelle diagnosemetoder har flere begrænsninger, som omfatter lav følsomhed, lang testtid og høje omkostninger. Derfor udtænkes test baseret på direkte genkendelse af DNA-og RNA-sekvenser. Den kommercielt tilgængelige DNA-probe til påvisning af Chlamydia er PACE 2-test (Probe Assay Chemiluminescence Enhanced)48, der også er i stand til at detektere Neisseria gonorrhoeae, som er en ikke-isotopisk DNA-probe til påvisning af specifikke dele af r-RNA af C. trachomatis i den endocervikale og urethrale prøve. En anden DNA-probe, PACE 2C-test er også blevet udviklet, som samtidig detekterer både C. trachomatis og N. gonorrhoeae fra en enkelt prøve; imidlertid, yderligere evaluering af PACE 2C er påkrævet inden dets anvendelse i diagnostik. Disse tests anvender en kemiluminescerende DNA-probe, der hybridiserer til en artsspecifik sekvens af chlamydial 16S rRNA. Når DNA – rRNA-hybrid er dannet, adsorberes den på en magnetisk perle, og det kemiluminescerende respons detekteres kvantitativt med et luminometer. Da aktivt opdelte chlamydiae indeholder op til 104 kopier af 16S rRNA, bør PACE 2-testen teoretisk være mere følsom end antigendetekteringssystemer. Følsomheden af PACE 2 i forhold til en DNA-amplifikationsstandard er endnu ikke blevet evalueret godt, men er rapporteret at være 77 til 93 procent48 i en undersøgelse.

udviklingen af tests baseret på nukleinsyreforstærkningsteknologi (NAAT) har været det vigtigste fremskridt inden for chlamydial diagnose, da in vitro-cellekulturteknikker erstattede æggeblommesækken til kultur og isolering af organismen fra kliniske prøver. NAAT er mindst 20-30 procent mere følsom (i stand til at detektere så lidt som en enkelt genkopi) og 100 procent specifik49,50. Det giver mulighed for at bruge ikke-invasive prøver som urin til at screene for infektioner hos asymptomatiske personer, der normalt ikke ville søge klinisk pleje. Dette er en kritisk fordel, da størstedelen af chlamydiale infektioner hos kvinder og en betydelig del af infektioner hos mænd er asymptomatiske. Den mest kendte af DNA-amplifikationsteknologierne er PCR. PCR kan være slægt, art, gruppe eller stamme specifik afhængigt af primerdesignet. Gener, der er målrettet til diagnose af C. trachomatis, er MOMP-genet, det endogene plasmid, phospholipase-genet og 16S-og 23S rRNA-genet. Da alle nukleinsyreforstærkningsteknologier registrerer nukleinsyremål, afhænger disse ikke af levedygtighed eller en intakt tilstand af målorganismen for et positivt resultat. Derfor er transport af prøve ikke et kritisk problem49. Selvom det ikke er blevet undersøgt godt, ser “vinduet” for den kulturnegative, PCR-positive tilstand efter behandling med doksycyclin ud til at vare op til 3 uge 29. Efter denne tid bliver patientprøver både kultur og PCR-negative.

PCR-testen til påvisning af C. trachomatis udviklet af Roche Diagnostics (Roche-Amplicor) var den første PCR-test, der blev godkendt af FDA i Usa51. Siden 1993 har Amplicor PCR været relativt godt evalueret for både urogenitale prøver og urinprøver med en samlet følsomhed og specificitet på 90 og 99 til 100 procent, henholdsvis 51. Amplicor PCR er godkendt til cervikale, mandlige urinrør og mandlige urinprøver.

med eksplosionen af molekylærbiologiske teknikker nyere analyser som M2000-systemet (Abbott) såvel som strengforskydningsforstærkning (SDA) (BD ProbeTec strengforskydningsforstærkning udviklet af Becton Dickinson and Company, Diagnostic Systems, Franklin Lakes, N. J.) og transkriptionsmedieret amplifikation (TMA) (APTIMA-system af Gen-Probe, Inc., San Diego) blev tilgængelig for C. trachomatis. Selvom de er populære i de udviklede lande, forhindrer deres høje start-og vedligeholdelsesomkostninger deres anvendelse i ressourcefattige indstillinger.

byrden af C. trachomatis-organismer i kønsorganerne (chlamydial belastning) kan påvises ved kvantitativ realtids-PCR og kan variere fra 10 til over en million organismer/ml kønsorgansekretioner52. Dette vil sandsynligvis påvirke ydeevnen af forskellige nukleinsyreforstærkningstest, som ikke rutinemæssigt skelner mellem mennesker med høje og lave klamydiale belastninger. Forskelle i chlamydial belastning er rapporteret at være forbundet med tilstedeværelsen af kliniske symptomer, overførbarheden og persistensen af infektion og risikoen for at udvikle kroniske følge53. Derfor er der en kritisk rolle kvantificering i diagnosen og behandlingen af chlamydiale infektioner.

NAATs er de mest følsomme tests til screening og diagnose af chlamydial og gonokokinfektioner i kønsorganet54,55,56. Tvivl om deres præstationer i områder med lav prævalens rapporteres57,58. I 2002 anbefalede CDC at bekræfte alle positive NAAT ‘ er for C. trachomatis, når den positive forudsigelige værdi af testen er <90 procent59. De sande specificiteter ved NAAT-metoder viser sig imidlertid at være > 99 procent54,55.

CDC har også foreslået flere mulige strategier for bekræftelse59, som omfatter (i) testning af en anden prøve med en anden NAAT med samme eller højere følsomhed over for den første test, (ii) udførelse af en anden NAAT med samme eller højere følsomhed over for den første test rettet mod en anden nukleinsyresekvens på den originale prøve, (iii) gentagelse af den originale test på den originale prøve og (iv) at bringe patienten tilbage til en gentest.

imidlertid er de beskrevne begrænsninger, at de fleste klinikere ikke samler to prøver til den samme evaluering, og det er heller ikke muligt at bringe patienten tilbage for at indsamle en anden prøve, og de fleste laboratorier har ikke faciliteterne / evnen til at udføre to forskellige NAAT ‘ er.

begrebet bekræftende test er ikke nyt57. Imidlertid; det komplicerer håndteringen af en NAAT-positiv prøve og tilføjer omkostninger til en allerede dyr screeningstest. Der er også stadig plads til at forbedre Naats følsomhed, måske ved bedre prøveforberedelse, automatisering eller målkoncentration.

(ii) ikke-specifikke tests

leukocytesterase (LE) test er en hurtig målepindstest til brug sammen med urinprøver. Denne test er designet til at detektere urinvejsinfektioner ved at detektere det polymorfonukleære (PMN) celler. Positive le-testresultater forekommer med infektioner forårsaget af en række forskellige stoffer, herunder C. trachomatis og N. gonorrhoeae.

følsomheden af Le-testen til påvisning af C. trachomatis-infektion varierer meget fra 31 til 100 procent, og specificiteterne varierer fra 83 til 100 procent60. LE-testen er blevet betragtet som den bedste screeningstest for unge mænd og bør ifølge de fleste rapporter ikke bruges til test af prøver fra kvinder eller ældre mænd på grund af utilfredsstillende ydeevne.

(iii) Rapid point of care (POC) test

hurtige tests, også kaldet “point-of-care” – test for C. trachomatis anvender VVM-teknologi i formater, der primært er baseret på membranfangst eller lateks immunodiffusion. Hurtige tests udføres i lægens kontorer, kræver ikke avanceret udstyr, og kan være afsluttet i omkring 30 min. Resultaterne læses visuelt og er således kvalitative. Selvom flere sæt er kommercielt tilgængelige, men ingen er blevet evalueret godt. Generelt er de hurtige tests signifikant mindre følsomme og specifikke end laboratorieudførte VVM. Sammenlignet med PCR er følsomheden og specificiteten af Unipath Ltd., UK) var henholdsvis 53,8 og 99,1 procent med endocervikale vatpindeprøver og 31,1 og 95,2 procent med vaginale vatpindeprøver fra filippinske kvinder61. De hurtige tests giver kun en fordel i forhold til konventionelle laboratorietests, når der straks kræves resultater til patienthåndtering. Hurtige test bør ikke anvendes i en population med lav prævalens eller til asymptomatiske individer på grund af potentialet for falsk-positive resultater. Resultaterne af en hurtig test skal altid betragtes som formodede og skal, hvis de er positive, bekræftes af en laboratorietest.

afslutningsvis, selvom kultur er 100 procent specifik, kan dens estimerede følsomhed være så lav som 50 procent. De fleste laboratorier er flyttet væk fra kultur på grund af de involverede udgifter, tid og tekniske vanskeligheder. I stedet for kultur som en diagnostisk guldstandard anses den udvidede guldstandard/definerede referencestandard, dvs.almindeligt konsistent resultat med to ikke-kulturteknikker, for at være nyttig som forskningsværktøj43.

(iv) serologi

de serologiske tests er generelt ikke nyttige til diagnosticering af kønsorganinfektioner forårsaget af C. trachomatis. Antistoffer fremkaldt af C. trachomatis infektion er lang levetid og en positiv antistof test vil ikke skelne en tidligere fra en aktuel infektion.