plantemateriale

observationer og kemiske analyser blev udført fra 2011 til 2018 på en samling af planter dyrket i den eksperimentelle have på University Louvain-la-Neuve campus (50 liter 39’55″N; 4 liter 37’11″E). Før og under deres blomstringsperiode (juli–August) blev planter anbragt i universitetets vækstkamre under kontrollerede forhold (24/22 liter C; 16 L:8d, RH 80 liter 10%).

Insektmateriale

de vigtigste insektbesøgende arter af A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum og B. terrestris) blev brugt i forsøg med blomsterattraktivitet og gustatorisk præference. A. mellifera og B. pascuorum individer (10 pr.test og behandling) blev indsamlet i naturen omkring universitetscampus (mindst fire steder pr. Art) om morgenen før test. Som B. terrestris-individer kan ikke let skelnes i marken (lignende morfologi for flere arter), vi brugte humlebier fra fire nældefeber (Biobest, Vestloo, Belgien) placeret i nærheden af universitetsbygningerne for at få individer til eksperimentering.

blomsteregenskaber

pollenantal

støvknapperne på 10 blomster i Han-og hunfaser blev opsamlet, talt, tørret og anbragt på en sigte (90 liter), der skulle gnides for at samle pollenkorn. Mængden af pollenkorn blev vejet. Pollentællinger blev udført på Lille-1 University (Evo-Eco-Paleo Unit). Vi brugte en partikeltæller til at estimere antallet af pollenkorn i disse prøver. Dagen før pollentællinger blev prøver anbragt i en rørvarmer, indtil det meste af ethanolen fordampede. Vi tvang derefter anther dehiscence ved at placere prøver i en ovn kl 56 liter C natten over. Vi tilsatte 1 mL destilleret vand til hver pollenprøve. Rør blev derefter sonikeret og hvirvlet for at adskille pollenkorn fra støvknapperne og hinanden. Pollenopløsning (200 liter) blev derefter fortyndet i 5 mL isotonisk målebuffer (CASY-liter ton). Partikeltælleren analyserede tre 400-liter prøver fra pollensuspensionen, hvilket gav total partikelantal i dette 1200 liter volumen samt tæller for 400 størrelsesklasser i området fra 0,125 til 150 liter. Sammenligninger med blanke prøver tillod os at identificere toppe af partikler med størrelse fra 20 til 30 liter, hvilket svarer til pollenkorn. Antallet af pollenkorn pr. anther blev estimeret ved at multiplicere de værdier, der leveres af partikeltælleren, med fortyndingsforholdet (dvs.(1000/200) × (5000 + 200)/1200).

blomsterfarve og morfologi

vi målte blomsteregenskaber (corolla længde, corolla diameter, blomsterfarve og UV reflektans) på 10 blomster pr.fase (fra 10 forskellige individer). Hjelmbredde, corolla længde og diameter blev målt med en skydelære. Vi målte Tepal farve reflektans spektrum ved hjælp af et fiberoptisk spektrometer (Avaspec-ULS2048) og en lyskilde (AvaLight, Avantes, Apeldoorn, Holland). Til UV-refleksionsmålinger blev blomster fastgjort på en sort baggrund og fotograferet med en Nikon D40 (Coastal Optical 60 mm 1:4 UV-VIS-ir ApoMacro; filt 330).

Floral volatile collection

vi samplede flygtige organiske forbindelser (VOC ‘ er) fra intakte han – og hunfaseblomster (N = 4 for hver fase). Hver blomst blev indsat individuelt i en glaspære (50 mm længde og 30 mm diameter) med en åbning på 17 mm. For at forhindre luftforurening blev et Teflonrør fyldt med aktivt kul forbundet til den ene ende af glaspæren, og to glas Tenaks ta-rør (6 mm liter 4 mm, 7 tommer; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgien) blev forbundet til den anden ende. Petersborg, USA) med en strømningshastighed på 50 mL·min−1 i 180 min (mellem 11:00 og 14:00 h). Laboratorieforholdene varierede mellem 21,5 og 23,5 liter C med 45 Til 55% RH.

fangede VOC ‘ er blev derefter termisk desorberet på en Agilent 6800 gaskromatograf udstyret med en Gerstel TDU−termodesorptionsenhed og CIS-kryokøler opretholdt ved -50 liter C. umiddelbart efter termodesorption blev CIS-enheden T-liter programmeret fra -50 liter C til 300 liter C ved 12 liter C sek-1. GLC-apparatet blev koblet til et Agilent 7975 C massespektrometer. Analytiske betingelser var som følger: split mode injektion (med split ratio på 50:1, helium ved 1,6 mL min−1 som bæregas), VF-maks MS 30 m * 250 liter (DF = 0,25 liter) kolonne (Agilent). Temperaturen program giver den bedste adskillelse (foreløbige tests ikke vist), blev fastsat som følger: 40 °C (5 min) og derefter til 75 °C ved 4 °C min−1 og til 115 °C (3 °C min−1), og endelig til 250 °C 13 °C min−1. MS-betingelserne var som følger: EI-tilstand ved 70 eV, kilde t-liter = 250-liter C, MS-kvadrupol ved 200 liter C og scannet masseområde 35 til 500 amu.

de optagede kromatogrammer blev systematisk fortolket for at søge efter VOC ‘ er, der er specifikke for mandlige eller kvindelige faser. Når det blev detekteret, blev molekylerne identificeret i henhold til beregnede databaser (Viley 250.L og PAL 600). Identifikationerne blev bekræftet baseret på retentionsdata for rene molekyler, der er kommercielt tilgængelige. De blev også kvantificeret i forhold til meget ren intern standard (limonen, 1 liter methanolopløsning ved 0.67, før den termiske proces automatisk tilføjet til hvert desorptionsrør).

omgivende luft blev også opsamlet som en kontrol for at identificere baggrundsforurenende stoffer. For at forhindre et muligt gennembrud blev en anden glaspatron fyldt med det samme adsorbent (Tenaks TA) systematisk anbragt i tandem. Analysen afslørede ikke spor af molekylerne af interesse.

Alkaloidopsamling og analyser

støvknapper blev opsamlet fra 50 blomster (fra 10 individer), tørret og derefter knust på en sigte (90 liter) for at opsamle pollenkorn. Tre replikater af 15 mg pollen blev udtaget til alkaloider. Prøverne blev frosset (-80 liter C) i 2 timer og derefter frysetørret. Tørre prøver blev formalet til et fint pulver med flydende nitrogen, og vejede mængder pulver blev anbragt i et 1,5 mL mikrocentrifugerør (Eppendorf, Hamborg, Tyskland). Alkaloider blev ekstraheret under anvendelse af en vævshomogenisator (ultralyds renser) i 10 minutter i 100 liter ekstraktionsbuffer (70% vandig methanol og 0,5% myresyre). Efter centrifugering ved 12.000 o / min i 5 minutter (Centrifuge 5430 R) blev supernatanten overført til et 1,5 mL mikrocentrifugerør. Efter tørring i en SpeedVac blev alkaloider resuspenderet i 200 liter LC-MS-grade methanol og filtreret med et 0,45 liter PTFE sprøjtefilter.

nektar blev opsamlet i 5-karruselglaskapillarrør (Hirschmann Laborger priste, Eberstadt, Tyskland) fra 50 blomster (fra 10 individer). Tre replikater af 15 liter nektar blev tørret i en SpeedVac og resuspenderet i 200 liter LC-MS-grade methanol før filtrering med et 0,45 liter PTFE sprøjtefilter.kemiske analyser blev udført ved hjælp af et LC-MS/MS-system bestående af en Thermo Accela-pumpe, autosampler, fotodiode array detektor og en Thermo Scientific orbitrap massedetektor (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Belgien). Der blev anvendt en Gemini C18-søjle (2 mm liter 150 mm, pakket med 3-liter partikler). Et binært opløsningsmiddelsystem med en strømningshastighed på 300 liter min−1 blev anvendt: opløsningsmiddel a, HPLC-grade vand (0,1% myresyre); og opløsningsmiddel B, LC-MS-grade methanol (0 min: 95% a, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). Et volumen på 10 liter blev injiceret, og søjletemperaturen blev indstillet til 30 liter C. MS med høj opløsning blev udført med en elektrosprayioniseringskilde i positiv tilstand. Følgende indløbsbetingelser blev anvendt: kapillær temperatur, 275 liter C; kapillær spænding, 13 V; rørlinse, 140 V; kappe gasstrøm, 30 a.u.; og hjælpegasstrøm, 10 u.a. dataindsamling og-behandling blev udført med Kscalibur-programmer. Denne metode dækkede masseområdet for alle alkaloider (mv fra 329 til 673). Alkaloider fra pollen og nektar blev påvist og foreløbigt identificeret ved høj opløsning MS. Fragmentering opnået ved kollisionsinduceret dissociation hjalp med identifikationen. Alkaloidkoncentrationer blev beregnet ud fra en aconitinstandardkurve i MeOH og udtrykt som “aconitinækvivalent”. Analyserede alkaloider blev valgt ud fra deres tilstedeværelse i andre Aconitumarter4,8.

Nektarproduktion og sukkersammensætning

nektar blev opsamlet i 5-portr glas kapillarrør (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Tyskland) fra blomster af planterne overført i vækstkamrene på universitetscampus (ingen insektbesøg). Vi estimerede nektarproduktionstendensen i løbet af dagen i begyndelsen af antesen ved at prøve 2 blomster fra 12 individer hver 2.time i løbet af 10 timer. Vi målte også den samlede nektarproduktion pr.blomst (2 blomster fra 12 individer) for de samme blomster hver 2. dag i hele (9 dage) blomsternes levetid, på samme tid hver dag, 2 timer efter lyset var tændt. Den samlede produktion for han-og hunfaser blev estimeret ud fra prøveudtagning i slutningen af Han – (5 dage efter antese) og hun – (8 dage) faser.

Nektarprøver blev opbevaret ved -80 liter C, indtil der blev udført kemiske analyser. Efter afledning blev sukkeridentifikation og kvantificering udført af GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISK-KVD). Der blev anvendt en Restek RKSI-5SIL MS (30 m * 0,25 mm ID, 0,25 liter DF) kolonne. Strømningshastigheden var 1,0 mL min-1 (helium). De injicerede opdelingsforhold var 1/10 for sekskanterne og 1/100 for saccharose. Følgende indløbsbetingelser blev anvendt: ovntemperatur, 105 liter C i 4 minutter, derefter til 280 liter C ved 15 Liter C min−1 (i 20 minutter) og injektortemperatur på 250 liter C.Det samlede sukkerindhold i nektar pr.blomst (mg) blev derefter beregnet som volumen af nektar (liter) og total sukkerkoncentration (mg/liter).

Insektadfærd

i 2011 og 2012 fandt undersøgelser sted i de fire resterende naturlige populationer i fens i syd Belgien. Af disse indeholder naturreservatet “Les Abattis” (49 liter 40’50″N; 5 liter 32’59″E) den største og tætteste befolkning (2970 m2 med 1330 liter 1030 A. napellus Blomster m−2). Ved ” Fouches “(49 kr 4 ‘ 8 “N; 5 kr 43′ 06 ” E), som har den næststørste befolkning (1788 m2), individer af A. napellus var meget spredt over området og ved meget lavere tætheder (176 pund 177 Blomster m−2) “Chantemelle’ (49 pund 39’37″N; 5 pund 39’37″E)’ havde en diskontinuerlig befolkning bestående af tre pletter (161, 423 og 500 m2) med relativt lave plante−og blomstertætheder (179 pund 125 Blomster m-2). “Sainte-Marie”(49 liter 40’06″N; 5 liter 32’56” E) havde en lille og ujævn befolkning (292 m2, 152 liter 163 Blomster m−2) strækker sig omkring 150 m langs et tidligere jernbanespor.

Blomsterbesøgende blev registreret i observationer på 10 minutter under topblomstringen tre på hinanden følgende dage i 2011 (mellem 30.August og 3. September) og på fire dage i 2012 (mellem 21. og 27. August) med tørre og varme vejrforhold. Andelen af mandlige faseblomster i disse dage og i alle populationer var højere end kvindelige faseblomster (ca.85%). Blomster inden for 1 m2 (eller ca.fem planter) blev observeret på samme tid. Population blev udført (maksimalt 16) fordelt over hele populationerne og over forskellige tidspunkter i løbet af dagen. For hver besøgende registrerede vi arten, antallet af røvede og ikke-robbede blomster, der blev besøgt pr.plante og plaster, tid brugt pr. enkelt blomst samt deres foderadfærd (pollen-eller nektaropsamling, legitimt eller ulovligt besøg, kaldet røver (base-arbejde, primær og sekundær røver). I løbet af 530 min af blomsterobservationer i 2011 og 400 min i 2012 registrerede vi 183 blomsterbesøg. Humlebier (B. pascuorum og B. hortorum) og honningbier (Apis mellifera) var de største blomsterbesøgende; kun 3 B. terrestris individer blev observeret.

Pollen bæreevne

tredive individer pr.art blev dræbt med ethylacetat og individuelt lager. Pollen blev fjernet fra de forskellige insekt kropsdele med små terninger af gelatine-glycerin53. Pollenkorn koncentreret i corbicula blev fjernet og ikke inkluderet i analyser. Alle pollenkornene blev talt ved lysmikroskopi.

Pollenopsamling renhed

vi samplede pollenbelastninger fra humlebier, der besøgte A. napellus i de naturlige populationer. I laboratoriet blev pollenbelastninger acetolyseret53. Mindst 400 tilfældigt udvalgte pollenkorn af hver af de 25 pollenbelastninger blev identificeret og talt under lysmikroskopi.

gustatoriske reaktioner fra insektbesøgende

Vi fulgte protokollen fra Ma et al.54 til påvisning af aconitin. Når de blev fanget, blev individuelle bier sultet i 3 timer i et plasthætteglas (7 cm langt, 2,8 cm indvendig diameter) ved stuetemperatur og i fuldstændigt mørke i laboratoriet. Vi overførte hver bi til et holderør, et 15 mL centrifugerør med et 4 mm hul boret ved spidsen og et stykke stålnet fastgjort indeni. Efter en præ-testfase med en dråbe saccharose præsenterede vi testopløsningen i et 100-liters glaskapillarrør og pressede forsigtigt slangen for at opretholde opløsningen ved spidsen af røret. Ethvert insekt uden proboscis forlængelse efter 5 minutter blev fjernet fra testen. Testfaser var 2 minutter lange, og volumen af opløsningen før og efter testen blev registreret med en skydelære.

Test blev udført med tre besøgende arter (A. mellifera, B. pascuorum og B. terrestris). Ti individer pr. insektart blev testet med hver opløsning. Saccharose (430 liter mg−1) og aconitin (232 liter g−1) koncentrationer svarede til dem, der findes i vores art. Tre opløsninger blev præsenteret: deioniseret vand alene (kontrol), ren saccharoseopløsning og saccharose plus aconitinopløsning.

for alle test blev der beregnet et afskrækkelsesindeks for hvert individ fra valget til at drikke, mængden af forbrugt opløsning og tidspunktet for kontakt med opløsningen som følger: ID = 1 – (Valg for saccharose/valg for saccharose + aconitin) liter (mængde forbrugt af saccharose/volumen forbrugt af saccharose + aconitin) liter (tidspunkt for kontakt med saccharoseopløsning/tidspunkt for kontakt med saccharose + aconitinopløsning).

statistiske analyser

dataenes normalitet blev estimeret ved hjælp af Shapiro–test, og homoscedasticitet blev verificeret ved hjælp af Levene ‘ s test. Når normalitet og homoscedasticity krav blev opfyldt, analyser af varians (ANOVAs) blev udført (blomsterfaseeffekt på blomsterflygtige stoffer). I modsat fald blev der udført ikke-parametriske test ved hjælp af test til sammenligning af to betingelser (blomsterfaseeffekt på blomstermorfologi og nektarparametre) og test til sammenligning af mere end to betingelser (insekt-og opløsningseffekt på forbrugt volumen og kontaktvarighed med opløsningen i gustatoriske eksperimenter, insekteffekt på besøgsadfærd) og chi-kvadrat-test blev udført for at sammenligne procentdelen af individer i gustatoriske eksperimenter. ANOVA og ikke-parametriske analyser blev efterfulgt af multiparvis sammenligning, når mere end to betingelser blev sammenlignet. Alle analyser blev udført i SAS Enterprise Guide 7.1. Dataene præsenteres som middel til standardafvigelser.