게놈 시퀀싱 BC4 남자

우리는 샘플링 교잡는 남성 날짜 팜에 위치한 United States Department of Agriculture(USDA)/캘리포니아 대학교,리버사이드 농장에서 열,캘리포니아(USDA 가입니다 아니다. 파이 555415,소스 리브 7545PL). 이는 남성에 의해 제작되었대 backcrossing 로 Barhee 여성으로 재발하는 부모의 일부로 사육 프로그램에서 미국 농무부,미국에서 중단되었 1970s10,18. 전단지를 세척하고 고 분자량 DNA 추출 및 시퀀싱을 위해 Arizona Genomics Institute(University Of Arizona,Tucson,AZ)로 이송하기 전에 액체 질소에서 snap 을 냉동시켰다.

PacBio RSII 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 BC4 남성의 게놈을 시퀀싱 하였다. 시퀀싱을위한 고 분자량 DNA 는 작은 수정으로 Doyle 과 Doyle42 의 프로토콜을 채택한 어린 잎에서 추출되었다. PacBio 라이브러리 준비는 20kb 프로토콜을 따르고 3 개의 라이브러리(20,25 및 30kb 에서 젤 선택)가 구축되었습니다. 팔 SMRT 세포 시퀀싱에 RSII 시퀀 동영상 컬렉션의 시간을 6h. 에 대한 6.4 백만 읽었다 생성되는,총 72Gb 의 데이터(평균 이 프로그램은 길이 11.2kb,N50 18.5kb)입니다. 짧은 삽입 라이브러리(2×100bp 쌍 단부)의 추가 시퀀싱은 Illumina HiSeq2500 시퀀서로 수행되었습니다.

게놈 어셈블리

우리는 k-mer-based estimation 게놈의 크기에서 원 짧은 읽기 시퀀스의 BC4 남자 게놈을 어셈블리에 대한 목적(KmerFreq_AR 에 SOAPdenovo243)기본 설정으로 그리고 k-mer 길이 설정되 17. P.dactylifera 에 대한 실험적 게놈 크기 추정도 유동 세포 계측법을 사용하여 수행되었음을 주목하십시오(아래 참조). 파일러입 읽었으로 조립된 매-Unzip19(v.falcon-2017.06.28–18.01-py2.7-ucs2)씨와 함께 적용 범위의 55×k-mer 기반의 게놈 크기 예측의 774Mb 를 사용하여 입력할 수 있습니다. 압축 해제 모듈은 기본 설정으로 실행되었습니다.

결과 어셈블리에 의해 광택추 raw 파일러입 읽기와 전통과 화살표(부분의 SMRT 분석 suite v.2.3.0)뒤에 실행하여 Pilon44v.1.18 와 Illumina 짧은 읽기 시퀀스에서 BC4 남성입니다. 입력하 Pilon 에 의해 생산되었 트리밍 짧은 읽기와 Trimmomatic45(v.0.32)을 제거하는 3 개의 기지를 아래의 기본 품질의 Q30 읽어보다 짧은 30 뉴클레오티드. 그런 다음 읽기는 Bowtie246(v.2.2.6)이있는 화살표의 출력에 정렬되었습니다.

연마 된 1 차 contigs 는 allmaps22 로 기존 유전자 map21 의 LGs 에 고정되어 고정 된 haploid 어셈블리를 생성 하였다. 유전지도에 대한 스캐 폴드 서열은http://qatar-weill.cornell.edu/research/datepalmGenome/edition3/PdactyKAsm30_r20101206.fasta.gz로부터 얻어졌다. 에 맞춤 유전자 지도후 매뉴얼 검사의 재배치의 원 읽어 어셈블리에,우리는 발견 중 하나 인스턴스의 mis-어셈블리:하나의 최적화를 하는 c 컴파일했다면 분할 때문에 두 개의 최적화를 하는 c 컴파일한 끝에 병합되었을 머리에 머리.

게놈 주석

우리가 생성 RNA Seq 라이브러리에서 여러 khalal 단계 과일을(아래 참조),혼합물에 남성과 여성의 꽃봉오리(이하”꽃”아래),그리고 꽃가루 및 실시 2×100bp 짝-end 시퀀싱에 Illumina HiSeq2500 기기(테이블 보충 7). Leaf 및 root 의 추가 date palm RNA-Seq 데이터를 Sequence Read Archive(보충 표 7)에서 다운로드했습니다. RNA-Seq 판독은 Trimmomatic45 로 트리밍되었고,star47(v.2.4.0.1)으로 haploid 어셈블리에 정렬되었고,stringtie48(v.1.3.2)아우구스투스 49(2.3 절)에 대한 훈련으로 사용됩니다.

유전자 주석은 MAKER2pipeline50(v.2.31)을 사용하여 수행되었다. 상 동성 기반 증거는 7097ESTs(2017 년 2 월 9 일 NCBI EST 데이터베이스에서 다운로드 됨),Uniprot51 의 단백질 서열,date palm proteome,oil palm proteome52 및 rna-Seq 에서 유래 한 모델을 포함 하였다. Ab initio 예측은 Bowman et al.에 기술 된 바와 같이 훈련 된 Augustus(v.3.0)로 수행되었다.Rna-Seq 정렬로부터 StringTie48(v.1.3.2)으로 생성 된 유전자 모델 53.

원 MAKER2 주석이 구문 분석,제거하는 모델이 포함된 테 도메인과 부족한 전사 증거 또는 존재 Pfam 도메인에 설명된 대로 보 먼 et al.53. 약 1×의 비 organellar 싱글 엔드 WGS Illumina 읽기,de novo(비 어셈블리 기준)반복 라이브러리 제작되었습니다 RepeatExplorer54,그리고 분석에서와 같이 Copetti et al.55. 반복 주석의 어셈블리를 수행했 RepeatMasker(v.4.0.6;에서 뉴클레오티드 공간)와 Blaster56(의 일부 REPET2.5v,패키지 단백질이 공간)이상 조정에 단 하나의 주석 파일입니다. Noncoding RNAs 는 Rfam library58(v.12.2)으로 Infernal57(v.1.1.2)로 예측되었습니다. 1×10-5 의 e-값 임계 값 이상의 히트는 가족 별 수집 임계 값보다 낮은 점수를 가진 결과뿐만 아니라 필터링되었습니다. 두 가닥의 로치가 예측되었을 때 가장 높은 점수를 가진 히트 만 유지되었습니다. 전송 Rna 는 또한 기본 매개 변수가있는 tRNAscan-SE59(v.2.0)를 사용하여 예측되었습니다.

게놈 품질 평가

시각화의 게놈 어셈블리로 제작되었 어셈블리 통계 소프트웨어(보충 Fig. 1, ). 어셈블리의 완전성을 평가하였으로 특성화하는 유전자 공간으로 BUSCO20 를 사용하여 1440 식물 ortholog 그룹(v.3)와 정렬하여 ESTs 을 이배체 어셈블리 Blat60(v.350).

일 팜 게놈 크기 예측

게놈 크기는 추정을 사용하여 한 단계 cytometry 에 설명된 절차 Doležel et al.61 약간의 수정. 간단히 말해서,두 개의 P 에서 약 1cm2 의 잎 재료. dactylifera 샘플에서 왕립 식물원,런던,영국 컬렉션 배양을 위해 30 초 얼음에서 1ml 의”일반적인 목적을 버퍼”(케이블)62 로 보충 3%PVP-40 을 부드럽게 잎입니다. 그런 다음 교정 표준 Petroselinum crispum 의 잎 재료의 비슷한 양(밀.)소란(1C value=2201Mb)63 에 추가 되었고 결합 재료는 급속하게 다진(하지만 너무 적극적으로)을 이용하여 새로운 면도날. 추가 1ml 의 GPB 버퍼에 추가 되었고 다음 homogenate 었을 통해 필터링 30μm 나일론 메시(Celltrics30μm 메쉬,시스 멕스,Goritz,Germany)튜브로,100µl propidium 요오드화물(1mg/mL)에 추가되었고,샘플을 배양에 얼음 10min. 상대 형광의 5000 입자를 사용하여 기록되 Partec Cyflow SL3 흐름 cytometer(Partec GmbH,뮌스터,Germany)적합 100mW 녹색 solid-state 레이저(532nm,Cobolt Samba,Solna,스웨덴). 각 리프의 3 개의 복제가 처리되었고,출력 히스토그램은 FlowMax 소프트웨어 v.2 를 사용하여 분석되었다.4(Partec GmbH). 이 1C 값의 P.dactylifera(Mbp)었으로 계산:(의 피크는 위치의 P.dactylifera/의 피크는 위치의 P.crispum)×2201Mb(=1C 값의 P.crispum)63.

Gwas 패널

Gwas 에 대한 표현형은 아랍 에미리트의 두 농장에 위치한 날짜 야자 나무에서 수행되었습니다. 농장은 Hamriyah,Ras Al-Khaimah(n=46)및 Al-Shuwaib,Al-Ain,Abu Dhabi(n=111)의 Date Palm Research Center 에 있습니다. 인구는 주로 여성 상업 품종(n=145)으로 구성됩니다. 농장에서 자라는 수컷(n=12)도 주로 성 결정 궤적을 매핑하기위한 목적으로 서열화되었다.

Khalal 단계 과일 샘플 수집 가을 봄부터 2016 년,및 하 스냅 냉동에서는 액체 질소를 위한 RNA 시퀀싱 또는 수집으로 신선한 과일에 대한 촬영 스캔(아래 참조)및 특성 분석 기타 과일의 특성입니다. 같은 나무에서 나온 타마 무대 과일은 설탕과 유기산 프로파일 링을 위해 2017 년 여름에 수집되었습니다. 잎 샘플은 DNA 추출 및 게놈 시퀀싱을 위해 수집되었다.

게놈 DNA 는 식물 DNeasy mini kit(Qiagen,Venlo,Netherlands)를 사용하여 잎 또는 과일 mesocarp/epicarp 조직으로부터 추출되었다. DNA 추출 컬럼 및 illumina Nextera(San Diego,CA)키트를 사용하여 제조 된 라이브러리. 레인 당 최대 8 개의 라이브러리가있는 Illumina hiseq2500 시퀀서에서 2×100bp 페어링 엔드 시퀀싱을 수행했습니다. 을 읽었싱과 사람들을 통과 Illumina 품질 제어는 필터로 처리했 Trimmomatic45(v.0.36)오염을 제거하 어댑터습니다. 를 위해 어댑터 제거는,우리는 우리 사용되는 어댑터 Nextera transposase 시퀀스는 데이터베이스에 포함된 Trimmomatic(v.0.32)다운로드는 다음과 같은 설정 ILLUMINACLIP:〈어댑터 라이브러리〉:2:30:10MINLEN:76 지만 읽는 쌍을 모두 읽었 76bps 또는 더 이상 다음과 같은 자를 수 있습니다.

읽기는 bwa mem(v.0.7.15-r1140)을 사용하여 마스크되지 않은 BC4 수 어셈블리(기본 contigs 만 해당)에 정렬되었습니다. Bwa mem 정렬기는-M 옵션으로 실행되어 보조 읽기(0×800 비트 플래그)를 보조(0×100)로 표시합니다. 샘플 선형이었으로 처리 FixMateInformation(피카-도구 v.2.8.2;http://broadinstitute.github.io/picard)일관성을 보장하기 짝 정보를 읽고,SamSort(피카-도구 v.2.8.2)로 좌표를 정렬 선형,MarkDuplicates(피카-도구 v.2.8.2)플래그를 복제 읽 쌍으며,GATK64IndelRealignerTargetCreator/IndelRealigner 도구(gatk 를 v.3.7-0)재개를 읽고 indel 지역입니다. 샘플 정렬은 생산에 오류가 없는지 확인하기 위해 ValidateSam(Picard-tools v.2.8.2)을 사용하여 각 단계에서 검증되었습니다. 처리 된 정렬은 CollectAlignmentSummaryMetrics(Picard-tools v.2.8.2)및 Samtools 로 요약되었습니다.

SNP 전화 및 유전형

SNP-전화 및 유전형 진행되었 gatk 를(v.3.7-0)HaplotypeCaller 에서 실행 GVCF 모드는 다음에 합 유전형으로 GenotypeGVCFs. 읽어들을 필터링에서 HaplotypeCaller 단계는 사람들을 제외시키와 매핑은 품질의 20 미만과 사람들을 제외시키으로 표시된 중합효소 연쇄 반응(PCR)중복 또는 보조형(위 참조). 이 접근법은 모든 샘플에 걸쳐 32,384,028Snp 를 산출했습니다. SNP 필터링은 gatk v.4.0.2.1 을 사용하여 원시 변형에 하드 필터를 적용하여 수행되었습니다. 우리는 여과 원화 설정을 제외 Snp 저렴한(<>2862)요약에서 샘플입니다. 우리는 또한 포함 하지 않음 다중 유전자 Snp,Snp10bp 의 indel polymorphisms 및 Snp 회의는 다음과 같은 조건 QUAL<30QD<5.0. 유전자형이었으로 설정 없는 경우 DP 었 아래의 5 이상 20 뿐만 아니라,Snp 으로 유전자 전화 요금<80%,또는 사소한 대립 주파수 아래 0.01. 우리가 예상하는 P 값은 각 사이트에서디–Weinberg 평형을 사용하여 테스트 VCFtools65 및 필터링 Snp 를 보여주는에서 과잉 heterozygosity(정확한 테스트,P<0.05). 이 절차는 7,149,205Snp 의 필터링 된 호출 세트를 산출했습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 달리 명시되지 않는 한 R 통계 컴퓨팅 언어로 수행되었다.

LD 분석

ld 는 기준이없는 데이터에 적합한 r2 를 추정하는 방법을 사용하여 추정되었습니다(VCFtools65 참조). Gwas 패널에 대한 LD 붕괴 곡선은 Flowers et al.에서와 같이 계산되었다.4. 간략하게,R2 는 vcftools(v.0.1.14)에서–geno-ld 옵션을 사용하여 경미한 대립 유전자 빈도가 10%이상인 unphased Snp 에 대해 계산되었다. 감퇴 곡선을 생성한 피팅 커브 페어 r2 추정에 의해 물리적인 거리 SNP 쌍으로 비선형 적어도를 사용하여 사각형 접근 방식에서 적응 Marroni et al.66. 그런 다음 반 붕괴 거리는 r2 가 최대 값의 절반 인 거리(즉,1bp 거리)로 계산되었습니다.

특성화의 과일 컬러

팔 khalal 단계 과일의 상해당일 팜 다양한 수확 했,세척 탭으로 물을 제거하는 모든 먼지 및 후기-건조합니다. 과일을 세로로 얇게 썬 다음 두 가지 전략을 사용하여 과일 색을 측정했습니다. 첫째,우리는 촬영 슬라이스 과일과 색상 검사 카메라에서 사진 스튜디오 상자 사진을 찍은 흰 배경에는 디지털 카메라가 있습니다. 과일의 색상을 RGB 색상 매개 변수를 사용하여 ImageJ software67 로 분석했습니다.

둘째,우리는 색상 매개 변수 L*,a*,b*의 추정치를 얻기 위해 토마토 분석기 software68v.2.2 를 사용한 보완적인 접근법을 사용했습니다. L*좌표는 색상의 어두움과 밝음을 표현하며 검정(0)에서 흰색(100)까지 다양합니다. 좌표 a*및 b*표현 색상 방향,여기서+a*는 빨간색 방향,−a*는 녹색 방향,+b*는 노란색 방향 및−b*는 파란색 방향 68 입니다. 이미지 획득 및 분석은 Rodríguez et al.에 설명 된대로 수행되었다.27. 얇게 썬 과일은 검정색 배경을 가진 스캐너에 놓고 주변 빛의 영향을 피하기 위해 덮었습니다. 스캔 한 사진은 JPEG 파일로 저장되었으며 색상 매개 변수 L*,a*,b*의 추정치가 각 과일에서 수행되었습니다. 모든 과일의 평균이 계산되었습니다. 두 가지 방법의 상관관계가 매우 높은,그래서 우리는 사용 컬러 인덱스*/b*을 평가하기 위해 차이에 피부 색깔의 과일을 사용하는 위협회 연구이다.

과일 안토시아닌 콘텐츠

총 안토시아닌에서 추출되었 세 복제의 khalal 단계 과일에서 각각 날짜를 손바닥을 사용하여 다양한 과일 스냅-냉동에서는 액체 질소에 설명된 절차에 따라 Rabino 및 Mancinelli69 사소한 수정할 수 있습니다. 간단하게,안토시아닌 냉동에서 과일 피부(100mg)었으로 미세한 분말에서 추출 1ml 의 산성 메탄올(1%HCl)의 인큐베이션 실온에서 어둠 속에서 18 에서,다음 원심분리하여 10 분 12,000g. 의 정량화 총 안토시아닌 이루어졌을 사용하여 흡광도를 측정하여 분광광도계 사용하여 방정식

총 안토시아닌=(A530-0.25×A657)/FW 디 A530 및 A657nm 에 흡광도 및 FW 는 젖은 무게의 식물성 재료(g).

과일 크기

과일이 사용되는 사진을 위한 컬러 분석(위)포함되어 있는 통치자로 크기를 표준입니다. 그런 다음 ImageJ67(v.2)및 토마토 분석기 software27 을 사용하여 과일 길이와 너비를 추정했습니다.

과일 설탕과산 콘텐츠

과일 자당,포도당 및 과당을 정량 했다에서 125 개의 종류에 tamar 단계 때의 과일은 건조,익은 완전하고 무대에서는 날짜는 일반적으로 소모됩니다. 과일 스냅-냉동 -20°C,10~15 과일 당한 바로 유지 -20°C 을 통해 도착에 몽펠리에(프랑스 농산물 연구 센터를 위한 국제개발,새로운 리뷰는 내 google+)는 고성능 액체 크로마토그래피 분석이 수행되었다. 설탕과 산 특성 각각에 대해 두 개의 풀링 된 과일으로부터의 단일 측정이 얻어졌다. 날짜 조각(없이 석)냉동으로 액체 질소와 땅에서 분말,에 넣어 두 개의 단단한 유리제 작은 유리병에 저장된 -20°C 까지 샘플링입니다. 건조 물질의 경우,중복으로 1g 의 샘플을 칭량하고 70℃에서 72 시간 동안 진공 상태에서 스토브에 넣었다. 설탕 추출은 Bchir 등으로부터 적응 된 방법을 사용하여 수행되었다.70. 각 샘플에 대해 500mg 날짜 페이스트 및 10ml 의 80%에탄올을 물 욕조에서 80°C 에서 5 분 동안 가열 한 15ml 튜브에 넣었다. 각 관은 그 때 더 나은 퍼짐을 위한 15 분 동안 수동으로 그리고 그 후에 기계적으로 처음에 동요되었습니다. 9000×g(Avanti J-E 원심 분리기;BECKMAN-Coulter,BREA,CA,USA)에서 원심 분리 한 후,바닥을 두 번 추출하고 상등액을 모아서 0.45μm 로 여과하고 주입 하였다. 상기 방법은 산성 물(0.01N H2SO4)로 시험 하였다. 샘플 표준은 Sigma-Aldrich(ST.Louis,MO,USA)가 사용되었습니다.

과일 수분 함량

과일 샘플링을 수행하였으로 과일에 있는 설탕과산 콘텐츠 섹션이다. 두 과일에서 날짜 펄프를 회수하고 액체 질소로 분쇄하여 샘플을 균질화하고 -80°C 에서 저장하여 품종 당 단일 측정을 얻었다. 수분 함량은 샘플이 안정한 중량에 도달 할 때까지 70°C 에서 건조 된 2.5g 의 날짜 펄프 샘플의 중량 감소를 측정함으로써 중력적으로 결정되었다.

게놈 차원의 연관성 분석

우리는 gapit R package25 를 사용하여 게놈 차원의 연관성 매핑 분석을 실행했다. 계산 효율을 최소화하기 위해 여러-시험 문제만 제공 짙은 보도와 관련하여 LD 부패 거리,우리가 사용하는 5.5%다운샘플링 random SNP 설정(392,948Snp). A CMLM26 모두 사용하는 인구의 구조와 친족 관계 정보를 공변량으로 수행에 유전자형에서 157 날짜 팜 샘플입니다. 모집단 구조는 Snp(무작위로 샘플링 된)의 1%를 사용하여 Gapit 에 의해 생성 된 주성분 분석(PCA)으로 추론되었다. Gapit 은 PCA 의 처음 5 가지 구성 요소를 추가로 사용했습니다(그림 1). 1a;보충 자료 2). Vanraden 알고리즘(보충 데이터 3)을 사용하여 친족 관계를 유추했습니다. 유의 한 Snp 는 p<1.27×10-7 의 보수적 인 Bonferroni 임계 값을 사용하여 확인되었다. 유의 한 결과를 가진 형질에 대해,우리는 유의 한 Snp 가 확인 된 특정 LGs 에 전체 SNP 세트를 사용하여 두 번째 GWAS 분석을 추가로 수행했다.

의 특성을 이븐 Majid 및 VIR 유전자

우리는 이전에 확인되는 터너 같은 retrotransposon 삽입 다형성에 exon3 의 R2R3-MYB 전사 factor13(NCBI Gene ID: Loc103717680)는 오일 palm28 에서 Virescens(VIR)유전자에 직교적이다. 이의 특성을 retrotransposon,우리 PCR 증폭되는 요소에 긴 터미널 반복(뿐만 아니라 인접 VIR 유전자 시퀀스)에서 Thory 고 황후를 품종에서 수집 USDA 농장에서 열,캘리포니아 및 USDA/UC Riverside 농장을 각각 사용하여 GoTaq PCR 핵심 시스템(Promega,Madison,WI 미국)완충기와 효소.

프라이머 쌍 5′-TGT GTC CGG CAT TGC ACT TCT-3′(순방향)및 5′-GCT CAA TGT TGA TGT TGT TGG-3′(역방향)을 5’LTR 에 사용하였고,5′-ACTC TGA CTA CCA AGT ACT TGA TG-3′(순방향)및 5′-CTG CAC TAT TAT CAC AGT AGA TGG-3′(역방향)을 3’ltr 에 사용하였다.ltr. 증폭 된 제품은 GeneWiz(뉴저지 주 South Plainfield)에서 Sanger 시퀀싱을 위해 보내졌습니다. 우리의 게놈 어셈블리는 또한 삽입(~11.7kb)의 완전한 사본을 포함합니다. 블래스트는 일치하는 긴 터미널 반복 영역을 식별하기 위해 삽입 자체를 정렬하는 데 사용되었습니다. 프로그램 LTRdigest71 은 폭발 결과를 확인하는 데 사용되었습니다. 폭발 검색은 복사 번호를 결정하기 위해 날짜 팜 게놈에 대해 전체 이븐 마지드 서열을 쿼리했습니다.

보충 표 11 은 BC4 수컷 어셈블리에서 VIR 유전자에 대한 우리의 수동 주석의 좌표를 제공합니다. Date palm 품종에서 VIR exon3 에서 Ibn Majid 삽입의 유전자형은 JBrowse72 에서 삽입 영역에 걸친 정렬 된 읽기의 수동 검사에 의해 수행되었다. BC4 남성 게놈 어셈블리는 삽입 대립 유전자를 가지고 있기 때문에(VIRIM,도 1 참조). 3),야생형(VIR+)또는 비 삽입 대립 유전자에서 유래 한 매핑 된 읽기는 엑손 3 삽입 경계에서 소프트 클리핑된다. 우리의 존재는 소프트립 읽어(지원의 존재 VIR+전)또는 잘리지 않는 읽기에 걸친 exon3-삽입 경계(원의 존재 VIRIM 삽입 르)를 식별하 genotypes. 우리가 반복되는 이 절차를 검토하여 읽기 선형 모두에서 5’3’끝을 삽입에 BC4 남자 어셈블리와 샘플을 모두 5’3’유전자형 나왔고 일치하는 유전자형을 유지되었에 대한 분석입니다. 과일 색 표현형에 대한 우리의 관심을 감안할 때,우리는 여성 손바닥만을 유전형 화했습니다.

특성화 invertases 및 삭제 polymorphisms

의 시험에서 유전자 조 QTL 에 LG14(추가 데이터 6)처음에 공개 세 가지의 위치 후보—알칼리성/중립 당화(chr14G0028200)와 인접한 두 개의 세포벽 invertases(chr14G0022900 및 chr14G0023100)에 의해 예측이 우리의 유전자 주석 파이프라인. 우리는 확인에 대한 잠재적인 추가 됩니다 unannotated 사본의 당화에 이 지역에 맞추는 예측 성적 증명서의 유전자는 이를 사용하여 지역 Splign 내용을 게놈 맞춤 tool73. 이 복구된다 마이너스닥 시퀀스(는 우리가 CWINV2),close homology 을 측면 invertases CWINV1 및 CWINV3 에 2,489,373 을 2,485,592 지만,다중 삽입/삭제 영역에서 동종을 당화 CD exons.

삭제 변이 분석을위한 커버리지 깊이는 samtools bedcov74 를 갖는 500bp 비 중첩 빈에서 결정되었다(v.1.9)기본 설정 사용. Raw 깊이 값이 표준화되었으로 독립적으로 각 샘플을 분할하여 원 깊이의 각통 중간 원 깊이의 모든 구간에 LG14 하여 다음과 같 log2 변환 다음과 같은 꽃 et al.75. 샘플 genotyped 로 homozygous 삭제하고 다른 유전자 클래스에 대한 40kb 에 의해 삭제 보조의 수동 검사 그림. 12. A/N-INV1 의 상류 결실에 대한 동형 접합체 유전자형(그림 1). 4,보충 그림. 13)라고 했하여 임계값을 설정하도록 요구하는 적어도 하나의 500bp 간격에서 5kb 삭제 지역 log2 정규화된 깊이있는 보다 적은 -5. 현재,그것은 가능하지 않을 구별하 heterozygotes 에 삭제에 대한 대립에서 결과에 따르면 삽입으로 인해 적당한 범위에서 다시 시퀀싱 데이터입니다.

효소 당화 분석

두 자당과 두 개의 설탕을 줄이 품종 선택에 대한 당화 분석하지 않아도 됩니다. 이 실험은 4 가지 품종 모두가 매일 하나의 과일로 대표되는 이틀에 실시되었습니다. 분석 실험에서 수행되었나 khalal 단계 과일 스냅-냉동의 시간에서 컬렉션(위 참조)다음에 저장소에서 -80°C 조 추출물에서 얻을 수 있었 냉동 날짜 과일의 다음 프로토콜의 Hasegawa 및 Smolensky33. 각 언 과일이었 분쇄 박격포 및 유 봉(으로 씨를 제거)한 다음,지상 부엌에서 믹서기,그리고 5g 에 위치한 냉 추출 버퍼(20ml4.0%NaCl,1g 폴리비닐피롤리돈,PVP). 추가 침용 단계는 실험실 균질화기에서 1-2 분 동안 수행되었다. 추출한 다음 원심 분리 20,000×g15 분에서 4°C 로 상등액을 포함하는 수용성 당화에 저장되었음을 나머지 부분 원심 분리하여 두 번째 시간에서 20,000×g15 분에서 4°C 로 supernatants 결합되었고 10ml dialyzed 추위에 대한 물 4°밤새를 제거하는 설탕에서 추출물입니다. 샘플었 다고,반 샘플의 삶은 100°C 에서 측정 배경 활동에서는 잠재적 오염에서 설탕의 과일이다. 당화 활동의 비등 및 삶은 원유를 추출하는 다음을 측정하여 색도계 분석 결과에 Synergy H1 마이크로플레이트 리더기와 결합된 효소 assay kit(Sigma catalog no. MAK118)제조업체의 지침에 따라.

과일 RNA Seq 분석

두 개의 RNA-서열 데이터 수집하는 주소에 대한 질문에 과일 개발 및 변형에서 과일의 특성입니다. RNA Seq 에 다른 과일은 개발 단계에서 수행되었 과일 수 년에서 2014 년에 복제 나무에 있는 부 아랍 에미리트 대학교,대추는 조직문화 실험실에서 Al Ain,UAE. 이에 대한 실험,세 개 또는 네 개의 별도 나무의 Khenezi(다양한 빨강을 가진 과일)및 Khalas(노란 열매)종류 샘플링에서 반복적으로 45,75,105,120,135 일 후 수분 및 과일 스냅-냉동에서는 액체 질소입니다. RNA 었에서 추출된 단일 과일에서 각 세 개 또는 더 그루의 나무를 다음과 같은 다양한 표준에 대한 프로토콜 TruSeq 라이브러리 준비,그리고 2×101bp 짝-end 시퀀싱에서 수행 Illumina HiSeq2500.

2016 년 Al-Shuwaib 농장에서 채취 한 khalal stage 과일에 대한 두 번째 실험이 수행되었습니다. 세 가지 과일에서 수집된 각각의 여덟 손바닥의 각각 다른 다양한 선택에 따라 그들의 것 또는 가까운 극단의 자당을 줄이고 설탕을 입력 분포(즉,높고 낮은 농도는 자당). 과일 처리되었는 위에서 설명한대로와 라이브러리와 함께 건설 Nextera 라이브러리 제조 장비(Illumina)2×76bp 짝-end 시퀀싱에서 수행 NextSeq(Illumina)악기입니다.

미분 식 분석 수행한 트리밍 raw 시퀀싱과 함께 읽습 Trimmomatic45(v0.36)매개 변수 ILLUMINACLIP:〈어댑터 fasta〉:2:30:10 뒤:3 도:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36. 그런 다음 star split read aligner47(v.2.5.3a)및 카 생성되는 유전자 복용하여 이 동맹의 엑손으로프-count76(v.0.9.1)설정만을 포함하도록 독특한 매핑을 읽(즉,프-수 옵션–type=exon–mode=union–고유하지 않은=none). 읽기 수 정규화는 deseq277 의 중앙값-비율 방법(v.1.8.2)으로 수행되었다. 테스트 미분의 식 Virescens(Pdac_HC_chr4G0137100)사이에 빨간색(Khenezi,n=3 에 복제 라이브러리)와 황색(Khalas,n=3 개 또는 4 개의 복제 라이브러리)품종 실시 각각의 개발 시간을 점 45,75,105,120,135 일 후 수분. P 값은 각 단계에서 Khenezi 와 Khalas 발현 사이에 fold-difference 가 없다는 가설에 대한 Wald 의 테스트에 대해보고됩니다.

RNA seq 분석 차등적 유전자 발현의 invertases/N-INV1,CWINV1 및 CWINV3(Pdac_HC_chr14G0028200,Pdac_HC_chr14G0022900 및 Pdac_HC_chr14G0023100,각각)사이에 자당(n=4 종)를 줄이고 설탕 유형(n=4 종)실시되었을 구축하여 세관당에서 다양한 RNA 추출에서 독립적으로 세 가지 다른 과일을 따라 시퀀싱하여 각각의 라이브러리입니다. 분석의 차별 식이 자당 형 및 감소형 종류는 다음 수행에 맞추를 읽고 함께 성급(보상),계산을 읽으로프-계산하고,생성하는 원산 행렬에 DESeq2. 원 수당 유전자는 다음을 요약서 라이브러리에 대한 각각의 다양한으로 인하여 낮은 읽기 계산서 라이브러리입니다. 이후의 분석에 의해 실시되었다 첫째로 떨어지고 낮은 수치로 유전자(유전자를 가진<10 읽어 요약에서 모두 8 개의 샘플을)뒤에 표준 DESeq2(v.1.22.2)작업 흐름과 함께 네 개의 생물학적 복제(즉,날짜 손바닥 품종)각 치료 그룹에서. 미분 발현이 없다는 가설에 대한 수정되지 않은 P 값은 3 개의 후보 유전자에 대한 주요 텍스트에 제시되어있다.

보고 요약

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