GDF11PRO-Fc 바인딩하 모두 GDF11 및 MSTN

는 것을 보여주 GDF11PRO-Fc 수 있습 격리 active 성숙한 GDF11dimer 을 통해 직접적인 상호 작용 우리는 목적으로 확인 단백질-단백질 상호 작용 사이 GDF11 및 GDF11PRO-용하실 수 있습니다. 또한,GDF11 및 MSTN 성숙 이량 체의 밀접한 구조적 상 동성으로 인해,우리는 또한 GDF11PRO-Fc 가 MSTN 과 연관되는지 여부를 결정하고자했다. 를 식별하는 이러한 단백질-단백질 상호 작용,우리가 수행한 세트의 풀다운석(Fig. 1). Ligands rGDF11,rMSTN 및 rActivin 다 incubated 용해물 분수에서 HEK293cells 페 플라스미드 인코딩에 대한 GDF11PRO-Fc 또는 MPRO-Fc pH7.4. 변형 된 프로 펩타이드상의 접합 된 Fc 단편으로 인해,단백질 A/G 아가 로스 수지 상에 분획을 직접 끌어 내릴 수있다. 예상대로,GDF11PRO-Fc 는 rgdf11 과 rMSTN 을 모두 효과적으로 끌어내어 GDF11PRO-Fc 가 두 리간드를 결합 할 수 있음을 나타냅니다. 또한 MPRO-Fc 는 rgdf11 과 rMSTN 을 모두 성공적으로 끌어 냈습니다. 모두 GDF11PRO-Fc 및 MPRO-Fc 할 수 없었을 아래로 당겨 더 먼 관련 TGF-β ligand superfamily rActivin 는 것을 나타내는 ligand binding 은 특정(그림. 1). 더 바인딩 GDF11PRO-Fc,MPRO-Fc,rGDF11,rMSTN,또는 rActivin 는 관찰에서 제어 agarose 수지 않고 단백질/G. 에서 이러한 결과,우리는 결론 GDF11PRO-Fc 자발적으로 동료와 함께 성숙한 GDF11 및 MSTN 에서 이합체의 생리적 pH.

GDF11PRO-Fc 는 GDF11 및 MSTN 과 연관됩니다. 단백질-단백질 상호 작용 사이 GDF11PRO-Fc 또는 MPRO-Fc 및 rGDF11,rMSTN,또는 rActivin 다에 의해 결정됩 pull-down 분석하지 않아도 됩니다. GDF11PRO-Fc 또는 MPRO-Fc 를 4℃에서 1 시간 동안 rGDF11,rMSTN 또는 rActivin A 로 배양 하였다. Fc-융합 단백질 복합물 분리되었에 단백질/G 입히는 agarose 수지와 eluates 에서 실행 되었 12%SDS 페이지 젤을 감소에서의 조건 및 조사에 의 western blot. 입력 제어는 입력 재료의 5%였다. WB 웨스턴 오

GDF11PRO-Fc 블록 GDF11/MSTN 유발 위축에 C2C12myotubes

이외의 rGDF11 및 rMSTN 하는 차별화 된 myotubes 이전에 유도 표시 위축 murine C2C12 및 인간의 기본 골격 myotubes. 결정하는 데는 GDF11PRO-Fc 바인딩 GDF11 및 MSTN,우리는 다음을 요청하는 경우 GDF11PRO-Fc 을 막을 수 있습 GDF11/MSTN-유도 myotube 위축에서 차별화된 C2C12myotubes. 이를 달성하기 위해 GDF11PRO-Fc 에 대한 인코딩 DNA 서열을 aav6 캡시드에 패키징하여 AAV6-GDF11PRO-Fc 벡터를 생성했습니다. 에서 이러한 실험,AAV6 벡터가 선택되었는 능력을 효율적으로 선택적으로 변환시키는 차별화 된 C2C12myotubes 지만,myoblasts. C2C12myoblasts 교양과 차별화 된 5 일전을 치료 AAV6-GDF11PRO-Fc 또는 AAV6-EGFP(벡터 제어)에는 MOI105(Fig. 2a). 예상대로,GFP 현서 관 C2C12myotubes 에 감염된 AAV6-EGFP 에 48-72h post-감염의 정량화를 내면화 벡터 게놈당 복사본을 이배체에서 게놈 72h 감염 후 표시하는 벡터 전달되었을 적절하게 달성(Fig. 2b 및 c).

GDF11PRO-Fc 는 C2C12 세포에서 GDF11/MSTN-유도 된 myotube 위축을 차단합니다. C2c12myotubes 에서 실험 타임 라인을 자세히 설명하는 개략도. Aav6-EGFP 또는 AAV6-GDF11PRO-Fc 를 5 일 후 분화에 105 의 MOI 에서 C2C12myotubes 에 첨가하고 7 일째에 100ng/ml rGDF11 또는 rMSTN 을 첨가 하였다. Myotubes 는 10 일째에 염색되고 분석되었다. b EGFP 발현은 aav6-EGFP(MOI10)로 처리 된 c2c12myotubes 에서 48-72h 에서 분명했다. 눈금 막대는 50μm 를 나타냅니다. c 벡터 게놈 복사본을 번호는 한 이배체의 게놈 C2C12myotubes72h 후의 추가 AAV6-EGFP 또는 AAV6-GDF11PRO-Fc(MOI10). d C2c12myotubes 의 대표적인 면역 형광 이미지. C2c12myotube 막을 항-디스트로핀 항체(적색)로 염색함으로써 시각화되었다. 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었다. 인세 트는 확대 된 영역을 보여줍니다. 스케일 바는 50μm(메인 패널)및 25μm(패널 삽입)을 나타냅니다. e myotubes(분화 지수)에 통합 된 핵의 분율을 계산하고 대조군의 백분율로 제시 하였다. f 직경 측정의 제어 및(g)분포에 대한 평균 myotube 직경. Myotube 직경 측정을 위해,각 myotube 는 myotube 의 길이를 따라 3 점에서 측정되고 평균화되었다. h myotube 당 통합 된 핵의 수. 실험 조건 당 최소 50 개의 myotubes 가 분석되었습니다. 나는 tSMAD2/3 에 비해 psmad2/3 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. 동등한 단백질 로딩은 Ponceau S 염색에 의해 확인되었고 gapdh 는 로딩 대조군으로 사용되었다. 데이터는 세 가지 개별 실험의 결과를 나타냅니다. 모든 오차 막대는 평균±SEM 을 나타냅니다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. 칠 두 시간 후,myotubes 수정되었고 염색한 면역 분석을 사용하여 항체 인식 디스트로핀(rod22/봉 23)를 시각화하 myotube 주변 막고 dapi 에서 얼룩 myonuclei(Fig. 2d). 감소에서 차별화 지수,정의의 비율로 myonuclei 통합 myotubes,에서 관찰되었 myotubes 으로 처리 rGDF11(−15%,p=0.0008)또는 rMSTN(14%를,p=0.0013)상대 치료되지 않을 제어합니다. 그러나,이 효과는 rGDF11(−1.9%;p=0)로 처리 된 GDF11PRO-Fc-발현 C2C12myotubes 에서 둔화되었다.0047,rGDF11-처리 대조군과 비교)또는 rMSTN(-3.0%;p=0.0040,rMSTN-처리 대조군과 비교;Fig. 2e). 또한,AAV6-GDF11PRO-Fc 로 치료 된 C2C12myotubes 는 rGDF11 또는 rMSTN-유도 된 myotube 위축에 저항했다. 에서 상당한 감소 평균 myotube 직경에 상대적인 통제에서 발견 되었 myotubes 으로 처리 rGDF11(−39%;0.0002)또는 rMSTN(−35%;p=0.0003)에 비해 제어합니다. 반대로,GDF11PRO-Fc 를 발현하는 myotubes 는 rGDF11(−1.8%;p=0.0005,rGDF11 처리 대조군에 비해)또는 rMSTN(-5.3%;p=0.0075,rMSTN 처리 대조군과 비교)은 크게 영향을받지 않았다(그림 1). 2 층 및 g). 별도의 실험 GDF11PRO-Fc 을 방지 할 수 없 rActivin 유발 myotube 위축이 라인에서 관찰하는 GDF11PRO-Fc 결합하지 않 activin A(추가 파일 1:그림 S3)입니다.

치료 rGDF11 또는 rMSTN 또한과 관련된 낮은 비율의 성숙한 myotubes 으로 높은 숫자의 myonuclei 제안하는 억제의 myotube 차별화입니다. 11 개 이상의 myonuclei 를 가진 Myotubes 는 5.2%(p=0.0215)및 7.2%(p=0.0328)의 myotubes 는 각각 rGDF11 및 rMSTN 으로 처리 된 세포에서 분석되었습니다. 이에 비해,11 개 이상의 핵을 갖는 근이 튜브는 대조군 근이 튜브에서 분석 된 근이 튜브의 26%를 구성했다. 에 myotubes 을 표현하는 GDF11PRO-Fc 로 취급된 rGDF11 또는 rMSTN 의 비율 myotubes 과 11 개 이상의 myonuclei22%(p=0.0104 에 비해 rGDF11 처리 제어)19%(p=0.0404 에 비해 rMSTN 처리 제어),각각합니다(그림. 2 시간). 마지막으로,계약으로 어떠한 일들이 있을 것이라는 것을 다음과 같은 GDF11/MSTN 신호에 ActRII,의 증가 phosphorylated SMAD2/3(pSMAD2/3)단백질 레벨에서 myotubes 으로 처리 AAV6-EGFP 및 rGDF11 또는 rMSTN 었 관찰 웨스턴 오 후 24h 한 리간드(그림. 2i). 이 증가는 pSMAD2/3 수준을 결석에서 myotubes 으로 처리 AAV6-GDF11PRO-Fc 제안 GDF11PRO-Fc 식 반감 GDF11/MSTN-유도 SMAD2/3 의 활성화에서 차별화된 myotubes. 전반적으로,이러한 결과는 GDF11PRO-Fc 가 RGDF11 및 rMSTN-유도 된 myotube 위축 및 C2C12 세포에서의 분화 억제를 예방할 수 있었음을 나타낸다.

지역화된 GDF11PRO-Fc 식 유도 골격근에 있는 비대 성인 쥐

이전에,우리는 증명하는 조직 AAV 벡터 중재된 유전자의 전달 GDF11PRO-Fc 으로 신생아 쥐도에서 상당한 증가율 골격근의 성장입니다. 그러나 gdf11pro-Fc 가 단순히 골격근 성장을 향상 시켰는지 또는 실제로 골격근 비대를 유도했는지는 본 연구에서 불분명했다. 또한,그것을 가능하지 않았을 결정하는 경우에 효과 GDF11PRO-Fc 었 중재에 의해 현지 봉쇄 GDF11/MSTN 에서 골격근 경우 또는 관찰하 효과로 인해 조직의 변조 GDF11/MSTN. 이러한 질문을 해결하기 위해 우리는 성인 C57BL/6j 마우스에서 근육 내 AAV9-GDF11PRO-Fc 투여의 영향을 평가했습니다. 이 연구에서는 오른쪽 측면 힌드림 만 주입하고 대조 왼쪽 측면 힌드림을 대조군으로 사용했습니다.

체중은 aav9-GDF11PRO-Fc 로 치료 한 마우스에서 시간이 지남에 따라 약간 증가했습니다(10 주에+10%;p=0.0418;도 1). 3a). 또한,싱글 hindlimb 그립 힘을 정규화를 체중을 크게 증가 모두에서 사지 개별적으로 테스트,으로 더 큰 규모의 효과에서 보이 치료 오른쪽 hindlimb(+37%;p=0.0177)지만,중요한 증가 정상화 그립에서 치료되지 않는 왼쪽 hindlimb(+18%;p=0.0426)도 관찰되었다. 그러나,이 차이는 두 hindlimbs 가 동시에 시험되었을 때 유의성에 도달하지 않았다(+15%;p=0.2375;도 1). 3b). 벡터 투여 후 10 주 후,오른쪽 hindlimb 는 aav9-GDF11PRO-Fc 로 처리 한 마우스에서 눈에 띄게 컸다(도 1). 3 기음). 에서 마우스로 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc,젖은 조직의 질량 주입하고 오른쪽 전방 관련 유전자에(+50%;p=0.0046)및 비복근(+37%;p=0.0023)었다 훨씬 더 높은 비교하여 차량 처리 제어합니다. 치료되지 않은 좌측 힌드림 근육의 젖은 조직 질량에는 통계적으로 유의 한 차이가 없었다(그림 1). 3 차원). 근섬유 면적 분석은 평균 근섬유 단면적의 증가를 나타냈다(+15%;p=0.0078)에서 aav9-GDF11PRO-Fc-주사 된 우측 위식도(도 1). 3e 및 f). MFD 분포 분석은 또한 aav9-GDF11PRO-Fc 를 주사 한 마우스의 오른쪽 위층에서 더 큰 근섬유를 향한 변화를 밝혀냈다(그림 1). 3g),국소화 된 GDF11PRO-Fc 발현이 근육 비대를 유발했음을 나타낸다. 에서 별도의 동,우리는 또한 미치는 영향을 평가의 지역화된 유전자의 전달 GDF11 에 의해 근육 내 주사 AAV9-GDF11 으로 오른쪽 hindlimb,그리고 중요한 근 위축이 관찰되었 10 주 post-treatment 에 주입 hindlimb(추가 파일 1:그림 S4).

GDF11PRO-Fc 유도 지역화된 골격근 비 대한 후 근육내 유전자 전달. 8 주 된 C57BL/6J 마우스를 오른쪽 hindlimb 에 일방적 인 근육 주사를 통해 AAV9-GDF11PRO-Fc(n=5)또는 비히클(n=5)으로 처리 하였다. 대조 좌측 힌드림은 치료되지 않았다. 마우스를 치료 후 10 주 동안 안락사시켰다. 시간이 지남에 따라 평균 체중. b Hindlimb 그립 강도는 치료 후 10 주에 체중으로 정상화되었습니다. 단일 hindlimb 및 두 hindlimb 의 측정 값이 표시됩니다. c 대표 총 hindlimb musculature. 주입 된 힌드림은 검은 색 화살표로 지정됩니다. d tibialis 전방 및 gastrocnemius 의 젖은 조직 무게. e 근섬유를 시각화하기 위해 AlexaFluor-488-conjugated WGA 로 염색 된 주입 된 우측의 gastrocnemius 단면의 대표적인 면역 형광 이미지. 스케일 바는 100μm 를 나타냅니다. f 주입 된 오른쪽 gastrocnemius 에서 평균 근섬유 단면적. g 주사 된 우측 gastrocnemius 에서 Myofiber MFD 분포. 마우스 당 최소 500 개의 근섬유를 측정했습니다. 치료 된 마우스의 주입 된 오른쪽 위 위장관 및 간 샘플에서 조직 용해물에서 GDF11PRO-Fc 의 H 웨스턴 블롯 식별. Gdf11pro-Fc 는 비히클 처리 마우스에서 검출 할 수 없었다. 동등한 단백질 로딩은 Ponceau S 염색에 의해 확인되었고 gapdh 는 로딩 대조군으로 사용되었다. 모든 오차 막대는 평균±SEM 을 나타냅니다. *p<0.05;**p<0.01;n.s. 중요하지 않습;에 비해 차량 처리 제어합니다. TA 관련 유전자에 앞쪽,가스복근

웨스턴 오 분석 표시 GDF11PRO-Fc 단백질 발현에서 AAV9-GDF11PRO-Fc-injected 오른쪽복근(58kDa 밴드;Fig. 3 시간). 그러나,GDF11PRO-Fc 지 감지에서 치료되지 않는 왼쪽 측면복근에서 동일한 단백질량을 로드,제안하는 대부분의 골격근 GDF11PRO-Fc 식 지역화를 주입된 오른쪽 hindlimb(데이터시하지 않음). GDF11PRO-Fc 는 또한 일부 전신 노출이 발생했음을 나타내는 western blot 에 의해 간에서 검출 가능했다(도 1). 3 시간). 이 관찰은 주사 부위에서 전신 순환으로의 aav9 벡터의 혈관 누출에 기인 할 가능성이 큽니다. 이들 데이터로부터,우리는 gdf11pro-Fc 가 성체 마우스에서 골격근 비대를 유도한다는 것을 결정한다. 또한,이러한 효과 적어도 부분적으로 중재에 의해 현지 봉쇄 GDF11/MSTN 골격근,아마의 억제를 통해 리간드의 상호 작용과 함께 ActRII 골격근 조직입니다.

조직 GDF11PRO-Fc 유전자 전달 증가 골격은 근육량 및 강도에 mdx 쥐

다음에,우리는 우리의 영향을 평가 전신 GDF11PRO-Fc 식 mdx 쥐를 결정하는 경우 GDF11PRO-Fc 수 있다 또한 유 비대와 강도 증가에 dystrophic 골격근. 의 목적을 위해 이 재판 GDF11PRO-Fc 구성이 수정되었으로 돌연변이를 렌더링하는 그것이 통하지 않는 생 BMP1/TLD 같은 단백질 분해효소의 협곡(GDF11PRO-Fc D122A)증가 요인을 고집에서 조직의 순환이 있습니다. 이러한 실험을 모두 AAV9-GDF11PRO-Fc 및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 평가하였는지 여부를 설정 돌연변이 D122A transgene 으로 이어질 것이 더 뚜렷한 효과 in vivo. 전신 발현을 달성하기 위해,mdx 마우스를 꼬리 정맥 주입에 의해 벡터 또는 비히클로 처리 하였다. 정맥 내 전달에 이어,aav9 벡터는 마우스 간을 고효율로 형질 전환시킨다. 형질 전환 된 간세포는 트랜스 젠을 발현하고 단백질 생성물을 전신 순환으로 분비 할 수있다.

에서 시작하는 3 주 post-injection,우리가 관찰 체중에 상당한 증가는 유지의 기간에 대한 시험과 AAV9-GDF11PRO-Fc(+7.7%12 주;p=0.0094)및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A(+11%12 주;p=0.006)처리(Fig. 4a). 그것은 주목해야한다,그 때문에 dystrophic 병리학,mdx 쥐는 일반적으로 보상 근육의 비대할 수 있는 부분적으로 마스크에 있는 증가에 근육량에 의해 유도 된 GDF11PRO-Fc 표현이다. 근육 기능 검사와 관련하여,치료 된 마우스는 체중으로 정상화 한 후에도 증가 된 앞다리 그립 강도를 나타냈다. 그러나 정규화 된 앞다리 그립 강도의 차이는 aav9-GDF11PRO-Fc D122A 그룹에서만 통계적 유의성에 도달했습니다. 12 주 치료 후,평균 정상화 forelimb 그립 힘 증가했+28%(p=0.0873)와+36%(p=0.0248)에서 마우스로 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc 및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A,각각합니다(그림. 4b). 로타로드 성능은 평균적으로 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 처리에 의해 개선되었다(로타로드 대기 시간의+93%증가;p=0.0127). Rotarod 성능도 AAV9-GDF11PRO-Fc 그룹에서 향상되었지만,이 차이는 통계적 유의성에 도달하지 못했다(rotarod 대기 시간의+44%증가;p=0.2835;도 1). 4 기음). 그룹 중 어느 곳에서나 디딜 방아 달리기 시간에는 차이가 관찰되지 않았다(그림 1). 4d).

GDF11PRO-Fc 그립 향상 힘과 rotarod 성능 dystrophic mdx 쥐. 6 주 mdx 마우스로 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc(n=7),AAV9-GDF11PRO-Fc D122A(n=7),또는 차량(n=7)꼬리를 통해 정맥 주입입니다. 시간이 지남에 따라 평균 체중. b 앞다리 그립 강도는 시간이 지남에 따라 체중으로 정상화되었습니다. c Best rotarod time-to-fall 은 전처리(기준선)및 12 주 후 처리에서 기록되었습니다. 세 번의 시도에서 가장 좋은 시간이 분석에 사용되었습니다. d 전처리(기준선)및 12 주 후 처리에서 디딜 방아 지구력 테스트에서 총 거리 실행. 모든 오차 막대는 평균±SEM 을 나타냅니다. *p<0.05;**p<0.01;n.s. 중요하지 않습;에 비해 차량 처리 제어

의 끝에서 12-week trial,근 비대되었 심하게는 분명에 치료 쥐(Fig. 5a). Tibialis 전방,gastrocnemius 및 대퇴사 두근의 평균 젖은 조직 덩어리는+17%(p=0.0472),+20%(p=0.0011)및+14%(p=0.Aav9-GDF11PRO-Fc 그룹에서 각각 0333). 에 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 그룹,이러한 값을 추가로 증가했+26%(p=함유량이 0.0030 보다 큰 수),+31%(p=0.0003),그리고+23%(p=0.0009)을 통해 차량 대우에 대한 제어에서 변경 평균 관련 유전자에 앞쪽에 질량,복근,질량 및 허벅지 근육량,각각합니다. 또한,격막 젖은 조직이 대량 증가로+19%(p=0.0162)와+26%(p=0.0014)에 AAV9-GDF11PRO-Fc 및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 그룹,각각합니다. 흥미롭게도 심장 질량은 치료에 의해 크게 변하지 않았습니다. 평균 gastrocnemius myofiber 단면적은 aav9-GDF11PRO-Fc(+23%;p=0.0226)및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A(+25%;p=0.0170;Fig. 5c 및 d). 에 MFD 배급 분석,MFD 하는 경향이 최고 20~30μm 모든 그룹은 가능성으로 인해 높은 비율의 작은 재생 myofibers in dystrophic 근육이다. 그러나,치료 AAV9-GDF11PRO-Fc 및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 았는 결과의 증가 비율 myofibers 과목보다 더 높은 64μm 제안하는 요소 식했 유도 myofiber 비대(Fig. 5e)골격근에서.

GDF11PRO-Fc 는 영양 장애 mdx 마우스에서 골격근 비대를 유도합니다. 6 주 mdx 마우스로 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc(n=7),AAV9-GDF11PRO-Fc D122A(n=7),또는 차량(n=7)꼬리를 통해 정맥 주입입니다. 마우스를 치료 후 12 주 동안 안락사시켰다. 대표적인 총체적인 hindlimb musculature. b 사지 근육,횡격막 및 심장의 젖은 조직 무게. alexafluor-488-conjugated wga 로 염색 된 gastrocnemius 단면의 C 대표적인 면역 형광 이미지는 근섬유를 시각화합니다. 스케일 바는 100μm 를 나타냅니다. d Gastrocnemius 에서 평균 근섬유 단면적. gastrocnemius 에서 E Myofiber MFD 분포. 마우스 당 최소 500 개의 근섬유를 측정했습니다. aav9-GDF11PRO-Fc 로 처리 한 마우스의 간 조직 용해물 및 혈청에서 western blot 에 의한 GDF11PRO-Fc 의 F 식별. 동등한 단백질 로딩은 Ponceau S 염색에 의해 확인되었고 gapdh 는 간 조직 용해물에서 로딩 대조군으로 사용되었다. *p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;n.s. 중요하지 않습;에 비해 차량 처리 제어

웨스턴 오 분석 확인 단백질의 식 transgenes 에서 간과 전문의와 상담 바랍니다. 으로 예상되는,밴드에 58kDa 에 해당하는 전체 길이 GDF11PRO-Fc 또는 GDF11PRO-Fc D122A 었에서 감지 취급 쥐. 혈청 수준의 전체 길이 propeptide 었다 약간 높은 쥐에서 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 이에 그 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc 제안 혈청의 지속성 active propeptide 증가에 의해 D122A 돌연변이 있습니다(Fig. 5 층).

전반적으로,이러한 결과를 나타내는 조직의 표현 GDF11PRO-Fc 및 GDF11PRO-Fc D122A 증가 골격에서 근육량 dystrophic mdx 쥐고 있는 이 골격근 비대 연결 개선에 그립 힘과 모터 조정이다. 그러나 치료는 디딜 방아 달리기 성능에 따라 근육 지구력에 영향을 미치지 않는 것처럼 보였습니다. 또한,D122A 돌연변이 나타난 것을 약간 더 효과적인 증가하는 근육량 및 기능 때문에 아마도 향상된 혈청 지속성을 알려준다.

조직 GDF11PRO-Fc 유전자 전달을 감소하지 않습 dystrophic 병리학에서 mdx 쥐

다수의 연구보고 그의 봉쇄 TGF-β-ActRII-SMAD2/3 개의 신호는지 여부에 의해 MSTN 억제 또는 봉쇄 ActRII 있을 수도 있습 치료 혜택에서의 동물 모델 DMD. 영양 장애 병리학에 대한 AAV9-GDF11PRO-Fc 치료의 영향을 결정하기 위해 사지 근육과 횡격막의 조직 학적 분석을 수행했습니다.

특성 징후의 dystrophic 병리학,근육을 포함하여 괴,중앙 nucleation,근육내 콜라겐 증착,그리고 존재의 염증을 침투되었는 분명한 모든 mdx 그룹(Fig. 6a). Gastrocnemius 에서 aav9−GDF11PRO-Fc 로 처리 한 마우스에서 섬유 낭성 면적 백분율이-39%(p=0.0273)감소했습니다. Gastrocnemius 의 섬유증은 또한 aav9-GDF11PRO-Fc D122A 군에서 약간 감소되었다; 그러나,고 intersubject 다양성에서 다리 근육의 근육 섬유,이러한 차이에 도달하지 않은 통계적 유의성(−28%;p=0.1230;Fig. 6b). 거기에는 또한 상당한 차이가 관찰 비율에서 중앙의 핵 myofibers 제안 myofiber 재생에 적극적으로 발생하는 모든 그룹(Fig. 6 기음). 근육 분해의 마커 인 혈청 CK 는 또한 치료에 의해 크게 변하지 않았다(그림 1). 6d). 또한,항 마우스 IgG 면역 형광 염색에 의해 측정 된 근섬유 막 완전성의 국소화 된 열화는 모든 mdx 군에서 분명했다. 예기치 않게 mdx 마우스로 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 전시에서 약간의 증가 IgG-긍정적인 영역에서 평균적이지만,이러한 차이에 도달하지 않은 통계적 의미를(+55%;p=0.1729;Fig. 6e 및 f;추가 파일 1:그림 S5). 의 명백한 증 myofiber 괴사,재생,중앙 핵생성 및 IgG penetrance 없었다는 명백한 야생에서 유형 C57BL/10J 복근을 나타내는,이러한 마커에 특정 dystrophic 병리학(Fig. 6a-f;추가 파일 1:그림 S5).

GDF11PRO-Fc 는 mdx 마우스에서 영양 장애 병리를 완화시키지 않습니다. 6 주 mdx 마우스로 처리 AAV9-GDF11PRO-Fc(n=7),AAV9-GDF11PRO-Fc D122A(n=7)또는 차량(n=7)꼬리를 통해 정맥 주입입니다. 연령 일치 C57BL/10J(n=5)마우스도 야생형 대조군으로 포함되었다. 마우스를 치료 후 12 주 동안 안락사시켰다. C57bl/10J 및 mdx 마우스의 gastrocnemius 단면에서 대표적인 HE 및 MTC 염색. 중심 핵 생성은 모든 mdx 그룹에서 분명합니다. 근섬유 괴사 및 재생의 국소화 부위는 검은 색 화살표로 표시됩니다. 섬유 낭성 영역은 MTC 염색시 파란색 영역으로 표시됩니다. 스케일 바는 HE 섹션에서 50μm,MTC 섹션에서 100μm 을 나타냅니다. gastrocnemius 의 B 섬유 낭성 영역은 총 근육 단면적의 백분율로 표현됩니다. 중심 핵 생성을 나타내는 근섬유의 C 백분율. d 근육 손상의 마커 인 혈청 CK 의 순환 수준 측정. e gastrocnemius 조직 단면에서 마우스 IgG 염색(적색)의 대표적인 면역 형광 이미지. IgG 에 대한 양성 염색은 혈청 단백질에 대한 근섬유 투과성 및 막 완전성 상실을 나타냅니다. 섹션은 개별 근섬유를 시각화하기 위해 WGA 와 공동 염색되었습니다. 확대 된 영역은 흰색 상자로 표시됩니다. 특징적인 IgG 양성 근섬유는 흰색 화살표로 묘사됩니다. 스케일 바는 100μm 를 나타냅니다. f 총 근육 단면적의 백분율로 표현 된 IgG 양성 근섬유의 면적. c57bl/10J 및 mdx 마우스의 횡격막 단면에서 G 대표 HE 및 MTC 염색. 광범위한 병리학은 mdx 에서 명백하지만 C57BL/10J 마우스는 아닙니다. 스케일 바는 100μm 를 나타냅니다. 횡격막의 h 섬유 성 면적은 전체 단면적의 백분율로 표현됩니다. *p<0.05;***p<0.001;****p<0.0001;n.s.중요하지 않음; 에 비해 차량 처리 mdx 컨트롤

에서 다이어프램,H&E 염색을 공개한 광범위한 괴사와 근육내 콜라겐 deposition 모두에서 치료 및 치료 mdx 그룹(Fig. 6 그램). 무슨 유사한 관찰에서복근 근육,치료 AAV9-GDF11PRO-Fc 또는 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 생산하는 온화한 감소에서 격막 근육 섬유습니다. 횡격막의 평균 섬유 성 면적 백분율은 15%(p=0.0328)및 17%(p=0)로 감소 하였다.019)AAV9-GDF11PRO-Fc 및 AAV9-GDF11PRO-Fc D122A 처리로 각각(도 1). 6 시간). 예상 한 바와 같이,이러한 병리학 적 특징은 야생형 C57BL/10J 마우스의 횡격막에서 크게 존재하지 않았다(도 1). 6g 및 h). 에서 이러한 데이터는 우리가 결정 GDF11PRO-Fc 및 GDF11PRO-Fc D122A 할 수있는 약간의 근육을 억제하겐에 있는 공술서 다리 근육과막을 통해 3 개월의 기간입니다. 그러나 처리를 나타나지 않를 정지하는 지속적인 사이클의 근육성 및 재생에복근 또는 격막의 성인 mdx 쥐.