흡수 스펙트럼

흡수 스펙트럼의 티아민 기록되었에 대한 물(그림 1)의,그것을 발견되었다는 티아민시 최고 흡수(λ max)에 235nm. 때문에 높은 파란색이 변 λ 최대의 티아민,그 결정에 노출량 모양에 따라 직접 측정하고 그것의 흡수를 위한 자외선이 취약하는 잠재적 간섭에서 일반적인 첨가제. 따라서 가시 범위 흡수 종을 달성하기 위해 티아민의 유도 화는 의심 할 여지없이 필요했다. 따라서,NBD-Cl 을 갖는 티아민의 유도 화는 수행되었고,생성물의 흡수 스펙트럼은 시약 블랭크에 대해 기록되었다(그림 1). 이 제품은 434nm 에서 λmax 를 나타내는 갈색 색이며 NBD-Cl 의 λmax 는 342nm 인 것으로 나타났습니다. 티아민-NBD-Cl 유도체의 λmax 는 적색-시프트되어 잠재적 인 간섭을 제거 하였다. 따라서 파장 434nm 는 최적으로서 고정되었다.

최적화 반응의 조건

림 1:흡수 스펙트럼의 티아민(3),NBD-Cl(2)및 복잡한 그들 사이의(1).

최적의 조건을 위해 개발된 방법에 의해 설립 된 다양한 매개 변수 중 하나에서 시간 유지하면서 다른 매개 변수가 일정하고 다음과 같은 효과를 발휘에서 흡광도의 착색 제품입니다. 실험 조건을 확립하기 위해 NBD-Cl 의 pH,시간,완충 부피 및 농도와 같은 다양한 매개 변수의 영향을 조사했습니다.

Ph 의 효과

티아민과 NBD-Cl 사이의 반응에 대한 pH 의 효과는 pH 형태 7.0 을 12.0 으로 변화시킴으로써 시험되었다. 도 2 에 도시 된 바와 같이,생성물의 흡광도는 ph7.0 에서 낮아서 티아민이 중성 배지에서(NBD-Cl)와 반응 할 수 없음을 나타낸다. 이것은 아마도 친 핵성 치환 능력을 방해하는 염산염 염의 형태로 티아민의 아미노 그룹이 존재했기 때문일 수 있습니다. PH 가 7 에서 12 로 증가함에 따라,판독 값은 극적으로 증가하여 티아민의 아미노 그룹을 방출하고 친핵체 치환을 용이하게한다. 최대 흡수는 10.5 의 pH 값에서 달성되었다. 10.5 이상의 pH 값에서 흡수의 감소가 발생했습니다. 이것은 아마도 NBD-Cl 과 티아민의 후 향적 반응 속도를 증가시키는 수산화 이온 양의 증가에 기인 한 것이다.

반응 시간의 영향

반응 생성물의 흡광도를 상이한 시간에 모니터링 하였다(그림 3). 유지 다른 조건은 그대로 흡광도의 반응은 제품을 후 따라 서로 다른 시간에 걸쳐 25°C. 결과는 티아민과 반응 NBD-Cl25°C 에서 흡광도를 증가하기 시작하여 점차적으로 최대에 도달 한 후 25 분 소요. 더 긴 반응 시간 동안,흡광도의 약간의 강하가 관찰되었다. 이에 따라 25min 은 결정을위한 편리한 반응 시간으로 설정되었다.

의 효과 버퍼의 양

림 2:의 효과 pH 에서의 반응은 티아민과 NBD-Cl.
티아민(20μg/ml):1ml,NBD-Cl conc. 0.2%(w/v),반응 시간 20 분.

림 3:의 효력 반응 시간에 반응의 티아민과 NBD-Cl.
티아민(20μg/ml):1ml,완충액(pH10.5):1.5ml,NBD-Cl conc. 0.2%(w/v).

pH 를 10.5 로 유지하면 반응 생성물의 흡광도에 대한 완충 용액의 양의 영향도 연구되었다(그림 4). 그림을 보여 흡광도의 반응은 제품을 향상 빠르게 상승의 양을 버퍼의 솔루션과가 극대 때의 양을 버퍼를 해결책에 도달 1.5mL. 따라서,1.5mL 버퍼 용액의 양은 가장 높은 흡광도를 보장하기 위해 선택되었다.

의 효과 NBD-Cl 농도

연구의의 효과 NBD-Cl 농도 보이는 반응에 따라 시약니다. 가장 높은 흡수 강도는 0.2%(w/v)의 NBD-Cl 농도에서 달성되었으며,NBD-Cl 의 농도가 높을수록 흡광도가 감소합니다(그림 5).

위에서 매개 변수를 조정하는 실험,최적화된 사용되는 조건에 대한 분석 결과었:pH10.5,NBD-Cl 농도가 0.2%(w/v),볼륨의 버퍼 1.5mL,반응 시간 25 분과 온도 25ºC.

그림 4:NBD-Cl 과 티아민의 반응에 대한 완충량(ml)의 영향.
티아민(20μg/ml):1ml,완충액 pH:10.5,NBD-Cl conc. 0.2%(w/v),반응 시간 25 분.

림 5:의 효과 NBD-Cl 농도에서의 반응으로 티아민.
티아민(20μg/ml):1ml,완충액(pH10.5):1.5ml,반응 시간 25 분.

의 유효성 검사 방법

방법에 대해 확인된 다음 매개변수: 특이성,선형성,정밀도,정확도,lod(detection of detection),LOQ(limitation of quantitation)및 ICH(International Conference on Harmonization)지침에 따른 견고성.

선형성의 제한을 detection(LOD)제한의 정량화(LOQ)

선형성을 평가하여 선형회귀분석 결정을 구성하여 일곱의 농도 티아민의 범위에서 05–35µg/mL 는 계산하여 적어도 스퀘어 회귀분석을 계산하는 방법을 교정 방정식과의 상관관계 계수입니다. 보정 곡선은 선형 회귀 분석을 사용하여 농도 대 흡광도를 플로팅하여 구성되었습니다. 회귀방정식에 대한 결과를었=0.033x-0.009(r2=0.999),어디에는 흡광도에서 434nm,x 의 농도 티아민에 µg/mL 의 범위에서 05-35µg/mL,r 는 상관계수(표 1). 선형 농도 범위는 NQS 를 사용한 우리의 이전 방법과 비교할 수 있음이 밝혀졌습니다. 검출 한계(LOD)및 정량화 한계(LOQ)는 다음 식 LOD=3 에 따라 결정되었다.3×SDa/b,및 LOQ=10×SDa/b,SDa 는 절편의 표준 편차이며;b 는 ICH 가이드 라인 하의 기울기이다. LOD 및 LOQ 는 각각 0.667 및 2.020μg/mL 인 것으로 밝혀졌다(표 1).

정확

의 정확도를 제안한 방법으로 수행되었을 적용하여 3 가지 농도 10,20,30µg/mL 티아민 약품 내에서 선형 범위로 계산의 비율이 약물에서 회수 샘플을(표 2).

상대 오류(재)내 0.24%에 해당하는 표준 편차에 0.004 에 대한 세 가지 다른 결정을(표 3).

견고성.

반응 메커니즘:보고되었는 NBD-Cl 과 반응하여 아미노 그룹의 기본 또는 보조 아민 유도체. 마찬가지로,아미노의 그룹 티아민 역할을 할 수 있으로 친핵체로 인한 고독한 전자의 쌍에 질소 원자,트렌드를 공격에서 전자는 불충분한 센터에서 NBD-Cl(표 4&그림 6). 동시에,생성물의 조성은 티아민과 NBD-Cl 의 1:1 임을 입증 하였다(그림 7). 그래서 티아민의 아미노 그룹이 NBD-Cl 과 반응하여 갈색 부가 물을 형성한다고 결론 지었다. 반응 방정식은 그림 7 에 나와 있습니다.

그림 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

응용 프로그램의 제안된 방법을 분석 티아민의 노출량 모양

티아민 태블릿를 받게 되었을 분석하여 제안하고 라벨이 요구가 동의 새로운 방법으로 표 5. 제안 된 방법은 부형제에 의한 간섭으로부터 사실상 자유 롭다는 이점을 갖는다.

Figure 7: 1:1 화학량 론을 나타내는 NBD-Cl 과 티아민의 반응.