모바일 단계

모바일 단계에서 역상 크로마토그래피 혼합물의 물 또는 버퍼 극성 유기 용제와 같은 메탄올,아세토니트릴,이소프로판올(이소프로필 알코올),또는 테트라히드로푸란(THF). 용출 강도는 대략이 순서대로 증가합니다. 알콜은 양성자 기증자 인 반면 아세토 니트릴은 양성자 수용체입니다. 아세토니트릴/물 혼합물은 물과의 다른 용매의 혼합물과 비교하여 점도가 낮다. 이로 인해 배압이 낮아집니다. IPA/물 혼합물은 점도가 가장 높습니다. 가 낮기 때문에 배압에서 결과 낮은 점도,두 더 일반적으로 사용되는 유기의 모바일 단계 수정자는 아세토니트릴고 메탄올. 또한 아세토 니트릴은 다른 용매보다 훨씬 적은 저 UV 에서 흡수가 적습니다.

물은 역상 크로마토 그래피에서 가장 약한 용출 물입니다. 메탄올 또는 아세토 니트릴의 첨가는 유지를 감소시킨다. 유지 인자의 대수는 유기 용매 농도에 비례하여 대략 감소합니다. 면 분석은 작은 분자의 경우와 마찬가지로 대부분의 조제약,보존을 감소 거 칠중할 때 메탄올 농도의 모바일 단계에 의하여 증가에 대해 20%. 에서 많은 상황에서(예를 들면,법 개발)는 것으로 가정이 사이의 관계는 선형 대수의 보유 비율과 볼륨의 일부분 유기농 수정에서의 모바일 단계입니다. 그러나 이것을 엄지 손가락의 좋은 규칙으로 만 고려해야하며,이는 정확하거나 이론적으로 정당하지 않습니다.

인 solvation 의 속성을 아세토니트릴에 비해 메탄올로의 교체 중 하나 솔벤트와 다른 종종 결과에 변화에서 차입기의 분석은(그림 2). 따라서이 기술은 방법 개발에 자주 사용됩니다. 변화에서 하나의 수정을 다른 생 더 중요한 선택의 변화 보다는 변경 용매의 힘만으로(즉,을 변경하여 간단히 농도의 유기용매). THF 는 또한 선택성을 크게 변경합니다. 실제로,가장 큰 선택성 변화는 종종 일부 메탄올 또는 아세토 니트릴을 THF 로 대체함으로써 야기된다. 그러나 여러 가지 이유로 불쾌한 냄새가의 형성,과산화물고 불리한 자외 투명도,그것은 매우 자주 사용되지는 않았지.

그림 2. 분리의 선택성에 대한 이동 위상 수정 자의 영향. 상단,아세토 니트릴;바닥,메탄올. 열:XTerra RP18,4.6mm×50mm,3.5μm. 포름산 암모늄으로 pH3 에서 유기 0~80%에서 15 분 이상 2ml min−1 에서의 구배. 분석 물:1,트리 암 테렌;2,클로르 탈리 돈;3,althiazide;4,furosemide;5,benzthiazide;6,probenecid;7,ethacrynic acid;8,bumetanide;9,canrenoic acid. (다이앤 Diehl 와 김 트란,물 공사에 의해 제공 크로마토 그램.)

해석의 용매는 선택에 의해 복잡는 사실에 유기 용매에 흡착에 의해 고정 단계 ligands 고 간주 될 수 있습의 일부가 정지되는 단계입니다. 최근,여러 작가 측정 표면 초과하는 유기농 수정을 위한 표준 C18 형 고정상과 상당한 차이가 표면에 solvation 사이의 아세토니트릴고 메탄올.

이 섹션의 시작 부분에서 메탄올이 아세토 니트릴보다 높은 보유력을 제공한다는 것이 언급되었다. 이것은 비 이온화 된 화합물보다 이온화 된 화합물에 대해 더욱 두드러진다. 이것은 고정상에서 흡착 된 메탄올이 고정 상으로의 이온화 된 분자의 침투를 촉진한다는 관점에서 의미가 있습니다. 메탄올이 THF 와 비교 될 때 동일한 패턴이 발견됩니다. 이들은 메소드 개발에 유용한 기능입니다. 다른 한편,설폰 아미드 작용기를 갖는 화합물은 기준 분석 군과 비교할 때 THF 에서 상대적으로 더 많은 보유를 나타낸다. 전반적으로,상당한 영향을 미칠의 유기용매에서 선택성의 별을 관찰할 수 있지만,합리화하는 것은 어렵기 때문에,용매에서 찾을 수 있습을 모두 고정과 모바일 단계입니다. 일부 저자들은 또한 높은 물 함량 이동 상을 낮은 물 함량 상과 구별하려고 시도했다.

위에서 언급한 바와 같이,중요한 선택의 차이 다른 용제에 매우 유용한 도구 개발의 역상 분리. 고전적인 방법 개발 방식은 이동 단계에서 유기 개질제로서 메탄올,아세토 니트릴 및 THF 를 사용했다. 중간 선택성은 용매 혼합물로 얻을 수 있으며,피크 간격의 조정은 어려움없이 수행 될 수있다. 현대의 방법 개발 방식은 선택성의 조정에서 온도를 쉽게 제어 할 수있는 또 다른 변수로 사용합니다.

중요한 측면의 모바일 단계로 선택도의 pH. 의 통제 보존의 ionizable 화합물의 도움으로 버퍼 또는 산성 또는 자료 첨가제를 모바일 단계는 매우 중요합니다. 현명하게 이동할 수 있는 단계 pH 를 선택해서,사람은 보유와 선택성의 조작을 촉진할 수 있습니다. 전술한 바와 같이,분석물의 이온화된 형태와 비이온화된 형태 사이의 유지의 차이는 10-내지 30-배일 수 있으며,pH 조절이 중요하다.

최근 몇년 사이에,연구 결과는 모두 pH 및 이온화 상수의 버퍼를 변경할 때 유기 용제를 추가됩니다. 이는 보존 제어에 중요한 결과를 초래합니다. 이동상의 pH 가 분석물의 pka 로부터±2pH 단위 떨어져 있으면 일반적으로 분석물의 정의 된 이온화에 도달 할 수 있습니다. 그러나 ph 와 분석 pKa 가 모두 유기 용매를 첨가하여 변화하는 경우,이는 간단한 규칙을 사용하여 다루기가 쉽지 않습니다. 따라서,양호한 pH 제어 및 양호한 완충제는 이온화 가능한 분석물의 역상 분리의 재현성의 중요한 요소이다. PH 는 일반적으로 사용되는 버퍼의 pKa 값에 익숙한 물 속에서 측정되며,이 pka 값에 가깝게 머무르는 것을 선호합니다. 최대 버퍼 용량은 버퍼의 pKa 에서 찾을 수 있습니다. 유기 용매의 존재 하에서 pH 가 변하는 동안,완충 용량은 그렇지 않다. 역상 크로마토 그래피의 개업의에게 이것은 보존 제어의 중요한 측면입니다. 다른 한편으로,연구자의 역상 보유 메커니즘을 준비가 필요한 측정 pH 의 존재에 유기 용제를 완전히 이해하고 그에 영향을 보존. 전형적으로,유기 용매의 첨가는 산의 pKa 의 증가를 초래하고,염기에 대한 pKa 의 감소를 초래한다. 이는 버퍼와 분석물 모두에 적용됩니다. 이것은 분석 물의 예상되는 이온화 패턴에서 상당한 변화를 초래할 수있다. 다음은이를 보여주는 예입니다: 아민 함께 pKa 의 9 완전히 이온화에서는 인산완충 pH7 에서는 물이지만,그것만 있어도 절반 이온화에서 같은 버퍼만의 70%메탄올. 그러한 효과가 중요하다는 것은 분명합니다. 따라서,완충액을 준비하고 그 pH 를 제어하는 정확한 방법은 이온화 가능한 분석 물의 역상 유지의 양호한 제어를 위해 매우 중요하다.

다른 이온 상호 작용은 이온화 된 분석 물의 역상 분리의 유지 및 선택성에도 영향을 미친다. 이온 분석 물의 보유를 증가시키는 고전적인 도구는 이온 쌍 크로마토 그래피입니다. 이 기법에는,고정 단계입니다 equilibrated 과 함께 소수성을 청구온,같은 장 chain 술폰산이온(예를 들어,octylsulfonate)또는 소수성 급아민(예를 들어,tetrabutylammonium ion). 전형적인 모바일 단계 농도는 약 10mM. 또한 이온의 페어 시약의 모바일 단계 증가 보존 대상의 이온을 감소의 보유 이온의 요금으로 이온 쌍 시약,그리고 잎을 보유의 중립적 분석을 포함한 zwitterions 거의 영향을 받지 않습니다. 따라서 분리의 선택성을 조정하는 훌륭한 도구입니다. 선택성의 이러한 변화의 이유는 이온 쌍 시약이 고정상의 표면에 흡착된다는 사실 때문입니다. 결과 유지 메커니즘의 가장 간단한 해석은 역 위상 메커니즘과 이온 교환의 조합입니다. 으로 농도의 이온 쌍 시약에서의 모바일 단계 증가,보존의 반대로 충전 analytes 증가 처음에는,그리고 다음 수준에서 높은 농도. 체인 길이가 다른 이온 쌍 시약의 경우 체인 길이가 길수록 유지가 더 빠르게 증가합니다.

또 다른 이온-상호작용 효과로 발생하는 양이온 analytes 증가에 보존할 때 작은 무기 카운터 이온 추가된 모바일 단계입니다. 필요한 농도는 일반적으로 이온 쌍 시약과 함께 사용되는 농도보다 약 10 배 높습니다. 이 유형의 전형적인 음이온은 과염소산 염(ClO4−),테트라 플루오로 보레이트(BF4−)또는 헥사 플루오로 포스페이트(PF6−)입니다. 그들은 양이온 분석 물의 보유를 상당히 증가시킵니다. 이 효과는 메탄올보다 이동상 첨가제로서 아세토 니트릴로 더 두드러진다. 이 설명의 두꺼운 레이어 아세토니트릴에 흡착 고정 단계에 비해 단분의 계층 메탄올,그리고 파티션의 카운터 이온으로 이 layer. 에서 사용자 관점에서,보존 행동 양이온의 물질의 존재 하에서 이러한 무기 음이온이 비슷하지 관는 진정한 이온 쌍 시약,즉,long-chain 술폰산입니다.