Milano og fem andre byer holdt ud, og i Oktober 1238 måtte han hæve belejringen af Brescia. I samme år ægteskabet af Fredericks naturlige søn Ensio med den sardinske prinsesse Adelasia og udpegelsen af Ensio som konge af Sardinien, hvor pavedømmet hævdede overherredømme, førte til den sidste pause med paven. Frederik var dybt mistroisk både i religiøse og politiske spørgsmål: Frederik skulle have spøgt med, at Moses, Kristus og Muhammad var tre bedragere, der selv var blevet narret, og på den politiske arena var paven bange for, at de pavelige stater var ved at blive isoleret og omringet, især fordi der var dannet et pro-kejserligt parti i Rom. Under påskud af, at kejseren havde til hensigt at køre ham fra Rom, ekskommunikerede Gregory Frederick for anden gang på palmesøndag den 20.marts 1239. Dette var begyndelsen på den sidste fase af den gigantiske kamp mellem pavedømmet og imperiet; det endte med kejserens død og hans Huss undergang.

Frederick modvirkede ekskommunikationen med en række vigtige manifester, de fleste af dem komponeret af Pietro della Vigna, et medlem af imperial chancery, der havde fremragende litterære gaver. Manifestet understregede, at kardinalerne skulle deltage i kirkens ledelse, og Frederick forsøgte endda at fremkalde solidaritet blandt de sekulære prinser. Han intensiverede imidlertid også sine militære aktiviteter i det nordlige Italien. For at finansiere sit konstant voksende behov for våben indførte han en grundig administrativ omorganisering af det kejserlige Italien (blandt andet dannelsen af 10 viceregenser) og kongeriget Sicilien. Derudover besluttede han den strenge overvågning af befolkningen. I det centrale Italien tog han offensiven og besatte Ancona og hertugdømmet Spoleto, og i Februar 1240 marcherede hans hær ind i de pavelige stater og truede Rom. I sidste øjeblik vandt paven imidlertid romernes støtte.efter nederlaget for en genovesisk flåde, der bragte delegerede til et paveligt råd til Rom, blev mere end 100 højtstående kirkelige-kardinaler og biskopper blandt dem—ført som Frederiks fanger til Apulien. Denne militære sejr viste sig imidlertid at være en politisk ulempe: den leverede materiale til propaganda, der skildrede Frederick som en undertrykker af kirken.mens Frederik stadig lå i lejr før Rom, modtog han nyheden om Pave Gregorys død og trak sig derefter tilbage til Sicilien. I mellemtiden havde mongolerne invaderet Europa. De blev midlertidigt standset i det ekstremt blodige slag ved Liegnits i Schlesien den 9. April 1241, men sandsynligvis forhindrede kun den pludselige død af deres leder, den store khan Kurt, yderligere mongolske fremskridt på det tidspunkt.Celestine IVS korte pontifikat blev efterfulgt af et langt interregnum. Da Innocent IV i 1243 blev valgt, indledte Frederik på opfordring af de tyske fyrster og kong Louis i Frankrig forhandlinger med den nye pave. Aftale mellem paven og kejseren syntes tæt på evakueringen af de pavelige stater, da i Juni 1244 uskyldige flygtede byen. I Lyon indkaldte han til et råd i 1245 og afsatte i juli samme år kejseren, hvor hindringen for forsoning tilsyneladende var Status for Lombard-kommunerne.

kampen mellem kejseren og pavedømmet rasede derefter i fuld raseri. På den pavelige side blev kejseren mærket som forløber for Antikrist; på den kejserlige side blev han hyldet som en Messias. Kejseren støttede det moderne krav om, at kirken skulle vende tilbage til fattigdom og hellighed i det tidlige kristne samfund og appellerede igen til Europas Fyrster om at deltage i en defensiv liga mod de magthungrige prælater. De fleste af fyrsterne forblev imidlertid neutrale, og selvom to på hinanden følgende tyske antikinger fik ringe støtte, mistede kejseren støt terræn i Tyskland.

i Maj 1247 Fredericks planlagte rejse til Lyon for at påberåbe sig sin egen sag, før det pavelige råd blev afbrudt af oprøret i den strategisk placerede by Parma. I kølvandet på denne debakel gik meget af det centrale Italien og Romagna tabt. Det følgende år skulle kejseren lide yderligere slag af skæbnen; Pietro della Vigna, i mange år kejserens fortrolige, blev beskyldt for forræderi og begik selvmord i fængsel. I Maj 1249 blev kong Ensio af Sardinien, Frederiks yndlingssøn, fanget af Bolognese og blev holdt fængslet indtil sin død i 1272.

kejserens position, både i Italien og—gennem indsatsen fra hans søn, Conrad IV—i Tyskland, blev bedre, da han døde uventet i 1250. Han blev begravet i katedralen i Palermo nær sin første kone, hans forældre og hans normanniske bedstefar.

da nyheden om hans død blev offentliggjort, blev hele Europa dybt rystet. Der opstod tvivl om, at han virkelig var død; falske Fredericks dukkede op overalt; på Sicilien voksede en legende, at han var blevet overført til Aetna-vulkanen; i Tyskland, at han blev indkapslet i et bjerg og ville vende tilbage som sidste dages kejser for at straffe den verdslige Kirke og fredeligt genoprette det Hellige Romerske Imperium. Alligevel blev han også anset for at leve videre i sine arvinger. Faktisk var de dog inden for 22 år efter hans død alle døde: ofre for slaget med pavedømmet, som deres far var begyndt.