GDF11PRO-Fc blocca l’atrofia del miotubo indotta da GDF11 / MSTN nelle cellule C2C12. uno schema dettagliato timeline sperimentale in miotubi C2C12. AAV6-EGFP o AAV6-GDF11PRO-Fc è stato aggiunto ai miotubi C2C12 ad un MOI di 105 il giorno 5 post-differenziazione e 100 ng / ml rGDF11 o rMSTN è stato aggiunto il giorno 7. I miotubi sono stati macchiati e analizzati il giorno 10. l’espressione di b EGFP è stata evidente a 48-72 ore nei miotubi C2C12 trattati con AAV6-EGFP (MOI 10 ). Le barre di scala rappresentano 50 µm. numero di copia del genoma vettoriale c per genoma diploide in miotubi C2C12 72 h dopo aggiunta di AAV6-EGFP o AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). d Immagini rappresentative di immunofluorescenza di miotubi C2C12. Le membrane miotubi C2C12 sono state visualizzate colorando con un anticorpo anti-distrofina (rosso). I nuclei erano colorati con DAPI (blu). Riquadro mostra una regione ingrandita. Le barre di scala rappresentano 50 µm (pannello principale) e 25 µm (inserto del pannello). e La frazione di nuclei incorporati nei miotubi (indice di differenziazione) è stata calcolata e presentata come percentuale di controllo. f Diametro medio del miotubo relativo al controllo e (g) distribuzione delle misure del diametro. Per le misurazioni del diametro del miotubo, ogni miotubo è stato misurato in tre punti lungo la lunghezza del miotubo e in media. h Numero di nuclei incorporati per miotubo. Sono stati analizzati almeno 50 miotubi per condizione sperimentale. i pSMAD2 / 3 rispetto a tSMAD2/3 è stato valutato da Western blot. Lo stesso carico di proteine è stato verificato mediante colorazione Ponceau S e GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico. I dati rappresentano i risultati di tre esperimenti separati. Tutte le barre di errore rappresentano media ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Settantadue ore dopo, i miotubi sono stati fissati e colorati per l’analisi di immunofluorescenza usando un anticorpo che riconosce la distrofina (rod 22 / rod 23) per visualizzare le membrane periferiche dei miotubi e DAPI per macchiare i mionuclei (Fig. 2d). Una riduzione dell’indice di differenziazione, che è definita come la proporzione di mionuclei incorporati nei miotubi, è stata osservata nei miotubi trattati con rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) o rMSTN (− 14%, p = 0,0013) rispetto al controllo non trattato. Tuttavia, questo effetto è stato attenuato nei miotubi C2C12 che esprimono GDF11PRO-Fc trattati con rGDF11 (- 1,9%; p = 0.0047, rispetto al controllo trattato rGDF11) o rMSTN (- 3,0%; p = 0,0040, rispetto al controllo trattato rMSTN; Fig. 2e). Inoltre, i miotubi C2C12 trattati con AAV6-GDF11PRO-Fc hanno resistito all’atrofia dei miotubi indotta da rGDF11 o rMSTN. Una sostanziale diminuzione del diametro medio del miotubo rispetto al controllo è stata rilevata nei miotubi trattati con rGDF11 (− 39%; 0,0002) o rMSTN (- 35%; p = 0,0003) rispetto al controllo. Al contrario, i miotubi che esprimono GDF11PRO-Fc trattati con rGDF11 (- 1,8%; p = 0,0005, rispetto al controllo trattato con rGDF11) o rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, rispetto al controllo trattato con rMSTN) erano in gran parte inalterati (Fig. 2f e g). In un esperimento separato, GDF11PRO-Fc non è stato in grado di prevenire l’atrofia miotubica indotta da rActivin A, che è in linea con l’osservazione che GDF11PRO-Fc non lega activin A (File aggiuntivo 1: Figura S3).

Il trattamento con rGDF11 o rMSTN è stato anche associato a una percentuale inferiore di miotubi maturi con un numero maggiore di mionuclei, il che suggerisce un’inibizione della differenziazione dei miotubi. I miotubi con più di 11 mionuclei comprendevano solo il 5,2% (p = 0,0215) e il 7,2% (p = 0.0328) di miotubi analizzati in cellule trattate con rGDF11 e rMSTN, rispettivamente. In confronto, i miotubi con più di 11 nuclei costituivano il 26% dei miotubi analizzati nei miotubi di controllo. Nei miotubi che esprimono GDF11PRO-Fc che sono stati trattati con rGDF11 o rMSTN, la proporzione di miotubi con più di 11 mionuclei è stata del 22% (p = 0,0104, rispetto al controllo trattato con rGDF11) e del 19% (p = 0,0404, rispetto al controllo trattato con rMSTN), rispettivamente (Fig. 2h). Infine, in accordo con ciò che ci si aspetterebbe dopo la segnalazione GDF11/MSTN a ActRII, un aumento dei livelli proteici SMAD2/3 (pSMAD2/3) fosforilati nei miotubi trattati con AAV6-EGFP e rGDF11 o rMSTN è stato osservabile su Western blot 24 h dopo l’aggiunta di ligando (Fig. 2i). Questo aumento dei livelli di pSMAD2/3 era assente nei miotubi trattati con AAV6-GDF11PRO-Fc, suggerendo che l’espressione di GDF11PRO-Fc antagonizza l’attivazione indotta da GDF11/MSTN di SMAD2 / 3 nei miotubi differenziati. Nel complesso, questi risultati indicano che GDF11PRO-Fc è stato in grado di prevenire l’atrofia dei miotubi indotta da rGDF11 e rMSTN e l’inibizione della differenziazione nelle cellule C2C12.

L’espressione localizzata di GDF11PRO-Fc induce l’ipertrofia muscolare scheletrica nei topi adulti

In precedenza, abbiamo dimostrato che la consegna genica sistemica AAV mediata dal vettore di GDF11PRO-Fc nei topi neonatali ha portato ad un aumento significativo del tasso di crescita del muscolo scheletrico . Tuttavia, non è chiaro da questo studio se GDF11PRO-Fc abbia semplicemente migliorato la crescita del muscolo scheletrico o abbia effettivamente indotto l’ipertrofia muscolare scheletrica. Inoltre, non è stato possibile determinare se gli effetti di GDF11PRO-Fc fossero mediati dal blocco locale di GDF11/MSTN nel muscolo scheletrico o se gli effetti osservati fossero dovuti alla modulazione sistemica di GDF11/MSTN. Per rispondere a queste domande, abbiamo valutato l’impatto della somministrazione intramuscolare di AAV9-GDF11PRO-Fc nei topi adulti C57BL/6J. In questi studi, è stato iniettato solo l’arto posteriore destro e l’arto posteriore controlaterale sinistro è stato utilizzato come controllo.

Il peso corporeo è leggermente aumentato nel tempo nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (+10% a 10 settimane; p = 0,0418; Fig. 3 bis). Inoltre, la forza di presa singola normalizzata al peso corporeo è stata significativamente aumentata in entrambi gli arti testati individualmente, con la maggiore entità dell’effetto osservato nel dorso destro trattato (+ 37%; p = 0,0177), sebbene sia stato osservato anche un aumento significativo della forza di presa normalizzata nel dorso sinistro non trattato (+ 18%; p = 0,0426). Tuttavia, questa differenza non ha raggiunto il significato quando entrambi gli arti posteriori sono stati testati contemporaneamente (+15%; p = 0.2375; Fig. 3 ter). Dieci settimane dopo la somministrazione del vettore, l’arto posteriore destro era visibilmente più grande nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3 quater). Nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc, la massa di tessuto bagnato del tibiale anteriore destro iniettato (+ 50%; p = 0,0046) e gastrocnemio (+ 37%; p = 0,0023) era significativamente più alta rispetto ai controlli trattati con veicoli. Non c’era differenza statisticamente significativa nella massa di tessuto bagnato dei muscoli posteriori del lato sinistro non trattati (Fig. 3d). L’analisi dell’area di miofibre ha rivelato un aumento dell’area media della sezione trasversale di miofibre (+15%; p = 0.0078) nel gastrocnemio destro iniettato AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3e e f). L’analisi della distribuzione MFD ha anche rivelato uno spostamento verso miofibre più grandi nel gastrocnemio destro dei topi iniettati con AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3g), indicando che l’espressione localizzata GDF11PRO-Fc ha indotto l’ipertrofia muscolare. In una coorte separata, abbiamo anche valutato l’impatto della consegna genica localizzata di GDF11 mediante un’iniezione intramuscolare di AAV9-GDF11 nell’arto posteriore destro e un’atrofia muscolare significativa è stata osservata 10 settimane dopo il trattamento nell’arto posteriore iniettato (File aggiuntivo 1: Figura S4).

GDF11PRO-Fc induce ipertrofia muscolare scheletrica localizzata dopo somministrazione intramuscolare del gene. topi C57BL/6J di 8 settimane sono stati trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) o veicolo (n = 5) tramite iniezione intramuscolare unilaterale nell’arto posteriore destro. L’arto posteriore controlaterale sinistro non è stato trattato. I topi sono stati sottoposti a eutanasia 10 settimane dopo il trattamento. un peso corporeo medio nel tempo. b Forza di presa degli arti posteriori normalizzata a peso corporeo a 10 settimane dopo il trattamento. Mostrato sono misure da un singolo arti posteriori ed entrambi gli arti posteriori. c Muscolatura rappresentativa degli arti posteriori grossolani. L’arto posteriore iniettato è designato con una freccia nera. d Peso del tessuto bagnato di tibiale anteriore e gastrocnemio. e immagini rappresentative di immunofluorescenza di sezioni trasversali gastrocnemio iniettate sul lato destro macchiate con WGA coniugato AlexaFluor – 488 per visualizzare le miofibre. Le barre di scala rappresentano 100 µm. f Area media della sezione trasversale di miofibre nel gastrocnemio destro iniettato. g Distribuzione di Myofiber MFD nel gastrocnemio destro iniettato. Sono state misurate almeno 500 miofibre per topo. h Western blot identificazione di GDF11PRO-Fc in lisati tissutali da gastrocnemio destro iniettato e campioni di fegato di topi trattati. GDF11PRO-Fc non è stato rilevabile nei topi trattati con veicoli. Lo stesso carico di proteine è stato verificato mediante colorazione Ponceau S e GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico. Tutte le barre di errore rappresentano media ± SEM. * p <0.05; **p< 0.01; n.s. non significativo; rispetto al controllo trattato con il veicolo. TA tibialis anterior, Gas gastrocnemius

Western blot analysis indicated that the GDF11PRO-Fc protein was expressed in the AAV9-GDF11PRO-Fc-injected right-side gastrocnemius (58 kDa band; Fig. 3h). Tuttavia, GDF11PRO-Fc non è stato rilevabile nel gastrocnemio sinistro non trattato alla stessa quantità totale di proteine caricate, suggerendo che la maggior parte dell’espressione del muscolo scheletrico GDF11PRO-Fc era localizzata all’arto posteriore destro iniettato (dati non mostrati). GDF11PRO-Fc è stato anche rilevabile nel fegato da western blot indicando che si era verificata una certa esposizione sistemica (Fig. 3h). Questa osservazione può essere probabilmente attribuita alla perdita vascolare del vettore AAV9 nella circolazione sistemica dal sito di iniezione . Da questi dati, determiniamo che GDF11PRO-Fc induce ipertrofia muscolare scheletrica nei topi adulti. Inoltre, questi effetti sono almeno parzialmente mediati dal blocco locale di GDF11 / MSTN sul muscolo scheletrico, probabilmente attraverso l’inibizione delle interazioni del ligando con ActRII sul tessuto muscolare scheletrico.

La consegna sistemica del gene GDF11PRO-Fc aumenta la massa muscolare scheletrica e la forza nei topi mdx

Successivamente, abbiamo valutato l’impatto dell’espressione sistemica GDF11PRO-Fc nei topi mdx per determinare se GDF11PRO-Fc potrebbe anche indurre ipertrofia e aumentare la forza nel muscolo scheletrico distrofico. Ai fini di questo studio, il costrutto GDF11PRO-Fc è stato modificato con una mutazione per renderlo impermeabile alla scissione endogena della metalloproteinasi tipo BMP1/TLD (GDF11PRO-Fc D122A) e aumentare la persistenza del fattore nella circolazione sistemica . Per questi esperimenti, sia AAV9-GDF11PRO-Fc che AAV9-GDF11PRO-Fc D122A sono stati valutati per stabilire se il transgene D122A mutato avrebbe portato ad un effetto più pronunciato in vivo. Per ottenere un’espressione sistemica, i topi mdx sono stati trattati con vettore o veicolo mediante iniezione di vena di coda. Dopo la consegna endovenosa, il vettore AAV9 trasduce il fegato del topo con alta efficienza. Gli epatociti trasdotti possono quindi esprimere il transgene e secernere il prodotto proteico nella circolazione sistemica .

A partire da 3 settimane dopo l’iniezione, abbiamo osservato un aumento significativo del peso corporeo che è persistito per tutta la durata dello studio con il trattamento AAV9-GDF11PRO-Fc (+7,7% a 12 settimane; p = 0,0094) e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+11% a 12 settimane; p = 0,006) (Fig. 4 bis). Va notato che, a causa della patologia distrofica, i topi mdx presentano tipicamente ipertrofia muscolare compensatoria, che può parzialmente mascherare l’aumento della massa muscolare indotto dall’espressione di GDF11PRO-Fc. Per quanto riguarda i test di funzionalità muscolare, i topi trattati hanno mostrato una maggiore forza di presa degli arti anteriori, anche dopo la normalizzazione del peso corporeo. Tuttavia, la differenza nella forza di presa normalizzata degli arti anteriori ha raggiunto solo la significatività statistica nel gruppo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A. A 12 settimane dopo il trattamento, la forza di presa normalizzata media degli arti anteriori è stata aumentata del + 28% (p = 0,0873) e del + 36% (p = 0,0248) nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, rispettivamente (Fig. 4 ter). Le prestazioni del Rotarod sono state migliorate anche dal trattamento AAV9-GDF11PRO-Fc D122A in media (+93% di aumento del tempo di latenza del rotarod; p = 0,0127). Le prestazioni del Rotarod sono state migliorate anche nel gruppo AAV9-GDF11PRO-Fc, ma questa differenza non ha raggiunto la significatività statistica (+44% di aumento del tempo di latenza del rotarod; p = 0.2835; Fig. 4 quater). Non è stata osservata alcuna differenza nel tempo di esecuzione del tapis roulant in nessuno dei gruppi (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc migliora la forza di presa e le prestazioni di rotarod nei topi mdx distrofici. topi mdx di 6 settimane di età sono stati trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) o veicolo (n = 7) tramite iniezione di vena di coda. un peso corporeo medio nel tempo. b Forza di presa dell’arto anteriore normalizzata al peso corporeo nel tempo. c Miglior tempo rotarod-to-fall registrato dal pre-trattamento (basale) e 12 settimane dopo il trattamento. Il miglior tempo da tre tentativi è stato utilizzato per l’analisi. d Corsa a distanza totale sul test di resistenza del tapis roulant dal pre-trattamento (basale) e 12 settimane dopo il trattamento. Tutte le barre di errore rappresentano media ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; n.s. non significativo; rispetto al controllo trattato con il veicolo

Alla fine del 12-settimana di prova, ipertrofia muscolare era grossolanamente evidente nei topi trattati (Fig. 5 bis). Le masse medie di tessuto umido del tibiale anteriore, del gastrocnemio e del quadricipite sono state aumentate del + 17% (p = 0,0472), del + 20% (p = 0,0011) e del + 14% (p = 0.0333), rispettivamente, nel gruppo AAV9-GDF11PRO-Fc. Nel gruppo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, questi valori sono stati ulteriormente aumentati a + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) e + 23% (p = 0,0009) rispetto al controllo trattato con il veicolo per la variazione della massa tibiale anteriore media, della massa gastrocnemio e della massa quadricipite, rispettivamente. Inoltre, la massa del tessuto bagnato del diaframma è stata aumentata del + 19% (p = 0,0162) e del + 26% (p = 0,0014) nei gruppi AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, rispettivamente. È interessante notare che la massa cardiaca non è stata significativamente modificata dal trattamento. L’area media della sezione trasversale di gastrocnemio miofibre era più alta nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Fig. 5c e d). Nell’analisi della distribuzione della MFD, la MFD tendeva a raggiungere un picco di circa 20-30 µm in tutti i gruppi, il che è probabilmente dovuto alla maggiore proporzione di piccole miofibre rigeneranti nel muscolo distrofico. Tuttavia, il trattamento con AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A ha determinato un aumento della percentuale di miofibre con MFD superiore a 64 µm, suggerendo che l’espressione del fattore aveva indotto l’ipertrofia delle miofibre (Fig. 5e) nel muscolo scheletrico.

GDF11PRO-Fc induce ipertrofia muscolare scheletrica nei topi mdx distrofici. topi mdx di 6 settimane di età sono stati trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) o veicolo (n = 7) tramite iniezione di vena di coda. I topi sono stati sottoposti a eutanasia 12 settimane dopo il trattamento. una muscolatura rappresentativa degli arti posteriori. b Peso del tessuto bagnato dei muscoli degli arti, del diaframma e del cuore. c Immagini rappresentative di immunofluorescenza di sezioni trasversali gastrocnemio colorate con WGA coniugato AlexaFluor-488 per visualizzare le miofibre. Le barre di scala rappresentano 100 µm. d Area media della sezione trasversale della miofibra nel gastrocnemio. e Distribuzione di miofibre MFD nel gastrocnemio. Sono state misurate almeno 500 miofibre per topo. f Identificazione di GDF11PRO-Fc mediante western blot nel lisato del tessuto epatico e nel siero di topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc. Lo stesso carico proteico è stato verificato mediante colorazione Ponceau S e GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico nei lisati del tessuto epatico. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. non è significativo; rispetto ai trattati con veicolo di controllo

Western blot analisi ha confermato l’espressione della proteina di transgeni nel fegato e nel siero. Come previsto, la banda a 58 kDa corrispondente a GDF11PRO-Fc a lunghezza intera o GDF11PRO-Fc D122A è stata rilevabile nei topi trattati. I livelli sierici del propeptide a lunghezza intera erano leggermente più alti nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc D122A rispetto a quelli trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc, suggerendo che la persistenza sierica del propeptide attivo era aumentata dalla mutazione D122A (Fig. 5 septies).

Nel complesso, questi risultati indicano che l’espressione sistemica di GDF11PRO-Fc e GDF11PRO-Fc D122A aumenta la massa muscolare scheletrica nei topi mdx distrofici e che questa ipertrofia muscolare scheletrica è associata a miglioramenti nella forza di presa e nella coordinazione motoria. Tuttavia, il trattamento non sembra influenzare la resistenza muscolare basata sulle prestazioni di corsa del tapis roulant. Inoltre, il mutante D122A sembrava essere leggermente più efficace nell’aumentare la massa muscolare e la funzione, presumibilmente a causa della migliore persistenza del siero.

La somministrazione sistemica del gene GDF11PRO-Fc non riduce la patologia distrofica nei topi mdx

Un certo numero di studi ha riportato che il blocco della segnalazione TGF-β-ActRII-SMAD2 / 3, sia mediante inibizione MSTN o blocco di ActRII, può avere benefici terapeutici nei modelli animali di DMD . Per determinare l’impatto del trattamento AAV9-GDF11PRO-Fc sulla patologia distrofica, abbiamo eseguito l’analisi istologica dei muscoli degli arti e del diaframma.

Segni caratteristici della patologia distrofica, tra cui necrosi muscolare, nucleazione centrale, deposizione di collagene intramuscolare e presenza di infiltrati infiammatori erano evidenti in tutti i gruppi mdx (Fig. 6 bis). Nel gastrocnemio, la percentuale dell’area fibrotica è stata ridotta di − 39% (p = 0,0273) nei topi trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc. Anche la fibrosi nel gastrocnemio era leggermente diminuita nel gruppo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A; tuttavia, a causa dell’elevata variabilità intersoggettiva nella fibrosi intramuscolare del muscolo degli arti, questa differenza non ha raggiunto la significatività statistica (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6 ter). Non è stata inoltre osservata alcuna differenza significativa nella proporzione di miofibre nucleate centralmente, suggerendo che la rigenerazione di miofibre si stava attivamente verificando in tutti i gruppi (Fig. 6 quater). Anche la CK del siero, un marker di disgregazione muscolare, non è stata modificata in modo significativo dal trattamento (Fig. 6d). Inoltre, il deterioramento localizzato dell’integrità della membrana di miofibre, come misurato dalla colorazione anti-immunofluorescenza IgG del topo, era evidente in tutti i gruppi mdx. Inaspettatamente, i topi mdx trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc D122A hanno mostrato un leggero aumento dell’area IgG-positiva in media, ma questa differenza non ha raggiunto la significatività statistica (+ 55%; p = 0,1729; Fig. 6e e f; File aggiuntivo 1: Figura S5). Segni evidenti di necrosi miofiberale, rigenerazione, nucleazione centrale e penetranza IgG non erano evidenti nel gastrocnemio di tipo selvaggio C57BL/10J, indicando che questi marcatori sono specifici per la patologia distrofica (Fig. 6a-f; File aggiuntivo 1: Figura S5).

GDF11PRO-Fc non attenua la patologia distrofica nei topi mdx. topi mdx di 6 settimane di età sono stati trattati con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) o veicolo (n = 7) tramite iniezione di vena di coda. I topi C57BL/10J (n = 5) abbinati all’età sono stati inclusi anche come controllo wild type. I topi sono stati sottoposti a eutanasia 12 settimane dopo il trattamento. un rappresentante HE e MTC colorazione da gastrocnemius sezioni trasversali di topi C57BL / 10J e mdx. La nucleazione centrale è evidente in tutti i gruppi mdx. Le aree localizzate di necrosi e rigenerazione della miofibra sono contrassegnate da una freccia nera. L’area fibrotica è rappresentata dalla regione blu sulla colorazione MTC. Le barre di scala rappresentano 50 µm nelle sezioni HE e 100 µm nelle sezioni MTC. b Area fibrotica nel gastrocnemio espressa come percentuale dell’area totale della sezione trasversale del muscolo. c Percentuale di miofibre che presentano nucleazione centrale. d Misurazione dei livelli circolanti di CK sierico, un marker di danno muscolare. e immagini rappresentative di immunofluorescenza di colorazione IgG di topo (rosso) nelle sezioni trasversali del tessuto gastrocnemio. La colorazione positiva per IgG indica la permeabilità della miofibra alle proteine del siero e la perdita dell’integrità della membrana. Le sezioni sono state co-colorate con WGA per visualizzare le singole miofibre. L’area ingrandita è contrassegnata da una casella bianca. Le caratteristiche miofibre IgG-positive sono raffigurate con una freccia bianca. Le barre di scala rappresentano 100 µm. f L’area delle miofibre IgG-positive espresse come percentuale dell’area totale della sezione trasversale muscolare. g Rappresentante HE e MTC colorazione da sezioni trasversali del diaframma di topi C57BL / 10J e mdx. La patologia estesa è evidente in mdx ma non nei topi C57BL/10J. Le barre di scala rappresentano 100 µm. h Area fibrotica nel diaframma espressa come percentuale dell’area totale della sezione trasversale. *p < 0.05; * * * p < 0.001; * * * * p < 0.0001; n. s. non significativo; rispetto ai controlli mdx trattati con veicoli

Nel diaframma, la colorazione H& E ha rivelato necrosi estesa e deposizione di collagene intramuscolare in entrambi i gruppi mdx trattati e non trattati (Fig. 6g). Analogamente a quanto osservato nel muscolo gastrocnemio, il trattamento con AAV9-GDF11PRO-Fc o AAV9-GDF11PRO-Fc D122A ha prodotto una lieve riduzione complessiva della fibrosi intramuscolare del diaframma. La percentuale media dell’area fibrotica nel diaframma è stata ridotta del 15% (p = 0,0328) e del 17% (p = 0.019) con trattamento AAV9-GDF11PRO-Fc e AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, rispettivamente (Fig. 6h). Come previsto, queste caratteristiche patologiche erano in gran parte assenti nel diaframma dei topi wild type C57BL/10J (Fig. 6g e h). Da questi dati, determiniamo che GDF11PRO-Fc e GDF11PRO-Fc D122A sono in grado di inibire leggermente la deposizione di collagene intramuscolare nei muscoli degli arti e nel diaframma per un periodo di 3 mesi. Tuttavia, il trattamento non sembra arrestare il ciclo in corso di degenerazione e rigenerazione muscolare nel gastrocnemio o nel diaframma dei topi mdx adulti.