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Staining Colorazione

by admin

Colorazione Nissl

Nuclei e corpi nissl (reticolo endoplasmatico ruvido) sono colorati di blu viola con cresile viola.

La colorazione Nissl viene utilizzata per la colorazione Klüver-Barrera (KB).

  • procedura di Colorazione
  • considerazioni Importanti per quanto riguarda la differenziazione

procedura di Colorazione

1 Deparaffinizzazione Xilene 3 cambi, 10 minunti ogni
2 Rimozione di xilene 100% di etanolo 3 modifiche per 5 minuti
3 Idratazione 95%, 70% etanolo 5 minuti ciascuno
4 Lavaggio Esecuzione di acqua del rubinetto 2 minuti
5 Risciacquo Distillata acqua
6 Colorazione 0.1% viola cresile soluzione 10 minuti, 37℃
7 Differenziazione 95% di etanolo + alcune gocce di 10% soluzione di acido acetico Circa 5 a 10 minuti. Si deve prestare attenzione a non sovradifferenziare poiché la decolorazione procederà nel passaggio successivo.
8 Differenziazione 95%, 100% etanolo Circa 1 minuto ciascuno. Differenziare fino a quando solo nuclei e corpi nissl sono blu viola.
9 Controllo microscopico Passo Step& may può essere ripetuto se è necessaria una maggiore differenziazione.
10 Disidratazione 100% ehtanol 2 modifiche per 5 minuti
11 Eliminare Xilene 3 cambi, 10 minunti ogni
12 Applicazione

0.1% soluzione acquosa di cresil violetto (Filtro prima dell’uso)

cresil violetto

1g

acqua distillata

1000ml

pH di cresil violetto

Il metodo di colorazione varia a seconda del pH della soluzione di colorazione. A un pH vicino a 3.0, solo i corpi Nissl, i nucleoli e le membrane nucleari sono macchiati di blu pallido. I nuclei delle cellule gliali sono solo leggermente macchiati. All’aumentare del pH, il colore diventa più scuro e il citoplasma delle cellule nervose, delle fibre nervose e delle cellule gliali sono co-colorati. La co-colorazione si intensifica vicino a un pH di 4.0. Pertanto, è necessario un tempo di differenziazione più lungo.


  • pH3.0

  • pH4.7

Tipi di viola cresile

Tre tipi di viola cresile sono attualmente utilizzati nel Laboratorio di Neuropatologia.

nome del prodotto produttore disponibilità
Viola cresile Acetato EM SCIENZA stock
Viola cresile acetato SIGMA commerciale
viola cresile (Acetato) MERCK commerciale

Differenziazione tempo varia a seconda della viola cresile prodotto

Il pH della soluzione di colorazione varia a seconda del prodotto. Pertanto, anche i metodi di colorazione differiscono. È importante essere consapevoli che il tempo necessario per la differenziazione differisce tra i prodotti. Tuttavia, qualunque sia il prodotto utilizzato, la stessa immagine cromatica macchiata può infine essere ottenuta attraverso la differenziazione e l’osservazione del campione al microscopio.

nome del prodotto produttore pH di 0,1% viola cresile soluzione Differenziazione tempo nel 95% etanolo
Viola cresile Acetato EM SCIENZA 3.5 per 10 a 30 secondi
Viola cresile acetato SIGMA 4.7 10min circa
viola cresile (Acetato) MERCK 4.8 10min circa

※ Il pH può essere regolata da 3,5 a 3,8 aggiungendo una quantità adeguata di acido acetico 10% per il Sigma e Merck colorazione soluzioni, che ridurrà il tempo necessario per la differenziazione con etanolo al 95%. Tuttavia, non è consigliabile riutilizzare questa soluzione.

Considerazioni importanti per quanto riguarda la differenziazione

Eseguire la differenziazione fino a quando lo sfondo diventa bianco. Avere i nucleoli e le membrane nucleari dei nuclei delle cellule nervose chiare e la cromatina debolmente macchiata è l’ideale.

L’acetato di cresile violetto (Sigma C5042) pH4.7 è stato utilizzato in entrambe le sezioni.

Fotografia a sinistra: differenziazione di etanolo al 95% per soli 10 secondi. Con una differenziazione insufficiente, l’intera cellula nervosa è macchiata di blu, rendendo impossibile identificare il nucleo e i corpi Nissl.

Fotografia a destra: differenziazione di etanolo al 95% per 10 minuti. Una differenziazione sufficiente consente di differenziare chiaramente i nuclei e i corpi Nissl dei neuroni.