Spettrofotometro a scansione a fascio singolo

Esistono due classi principali di dispositivi: singolo fascio e doppio fascio. Uno spettrofotometro a doppio fascio confronta l’intensità della luce tra due percorsi di luce, uno contenente un campione di riferimento e l’altro il campione di prova. Uno spettrofotometro a fascio singolo misura l’intensità luminosa relativa del fascio prima e dopo l’inserimento di un campione di prova. Sebbene le misurazioni comparative degli strumenti a doppio fascio siano più semplici e stabili, gli strumenti a fascio singolo possono avere una gamma dinamica più ampia e sono otticamente più semplici e compatti. Inoltre, alcuni strumenti specializzati, come spettrofotometri costruiti su microscopi o telescopi, sono strumenti a fascio singolo a causa della praticità.

Storicamente, gli spettrofotometri utilizzano un monocromatore contenente una griglia di diffrazione per produrre lo spettro analitico. La griglia può essere mobile o fissa. Se viene utilizzato un singolo rivelatore, come un tubo fotomoltiplicatore o un fotodiodo, la griglia può essere scansionata gradualmente (spettrofotometro a scansione) in modo che il rivelatore possa misurare l’intensità della luce a ciascuna lunghezza d’onda (che corrisponderà a ciascun “passo”). Possono essere utilizzati anche array di rivelatori (spettrofotometro array), come charge coupled devices (CCD) o photodiode array (PDA). In tali sistemi, la griglia è fissa e l’intensità di ciascuna lunghezza d’onda della luce viene misurata da un rivelatore diverso nell’array. Inoltre, la maggior parte dei moderni spettrofotometri a medio infrarosso utilizzano una tecnica di trasformata di Fourier per acquisire le informazioni spettrali. Questa tecnica è chiamata spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier.

Quando si effettuano misurazioni di trasmissione, lo spettrofotometro confronta quantitativamente la frazione di luce che passa attraverso una soluzione di riferimento e una soluzione di prova, quindi confronta elettronicamente le intensità dei due segnali e calcola la percentuale di trasmissione del campione rispetto allo standard di riferimento. Per le misure di riflettanza, lo spettrofotometro confronta quantitativamente la frazione di luce riflessa dai campioni di riferimento e di prova. La luce proveniente dalla lampada sorgente viene fatta passare attraverso un monocromatore, che diffratta la luce in un “arcobaleno” di lunghezze d’onda attraverso un prisma rotante e emette strette larghezze di banda di questo spettro diffratto attraverso una fessura meccanica sul lato di uscita del monocromatore. Queste larghezze di banda vengono trasmesse attraverso il campione di prova. Quindi la densità del flusso di fotoni (watt per metro quadrato di solito) della luce trasmessa o riflessa viene misurata con un fotodiodo, un dispositivo accoppiato a carica o un altro sensore di luce. Il valore di trasmittanza o riflettanza per ciascuna lunghezza d’onda del campione viene quindi confrontato con i valori di trasmissione o riflettanza del campione di riferimento. La maggior parte degli strumenti applicherà una funzione logaritmica al rapporto di trasmittanza lineare per calcolare l ‘”assorbenza” del campione, un valore proporzionale alla “concentrazione” della sostanza chimica misurata.

In breve, la sequenza di eventi in uno spettrofotometro a scansione è la seguente:

1. La sorgente luminosa viene brillata in un monocromatore, diffratta in un arcobaleno e divisa in due raggi. Viene quindi scansionato attraverso il campione e le soluzioni di riferimento.
2. Le frazioni delle lunghezze d’onda incidenti vengono trasmesse attraverso o riflesse dal campione e dal riferimento.
3. La luce risultante colpisce il dispositivo fotorivelatore, che confronta l’intensità relativa dei due raggi.
4. I circuiti elettronici convertono le correnti relative in percentuali di trasmissione lineare e/o valori di assorbanza / concentrazione.

In uno spettrofotometro a matrice, la sequenza è la seguente:

1. La fonte di luce è brillato nel campione e concentrata in una fessura
2. luce trasmessa, viene rifratta in un arcobaleno con il reticolo di riflessione
3. La risultante di luce colpisce la cellula fotoelettrica dispositivo che mette a confronto l’intensità del fascio
4. circuiti Elettronici convertire il relativo correnti in trasmissione lineare percentuali e/o assorbanza/valori di concentrazione

Molti anziani spettrofotometri deve essere calibrato con una procedura nota come “azzeramento”, per bilanciare il null corrente di uscita di due fasci al rivelatore. La trasmissione di una sostanza di riferimento è impostata come valore di base (datum), quindi la trasmissione di tutte le altre sostanze viene registrata rispetto alla sostanza “azzerata” iniziale. Lo spettrofotometro converte quindi il rapporto di trasmissione in “assorbenza”, la concentrazione di componenti specifici del campione in esame rispetto alla sostanza iniziale.

Applicazioni in biochimicamodifica

La spettrofotometria è una tecnica importante utilizzata in molti esperimenti biochimici che coinvolgono l’isolamento del DNA, dell’RNA e delle proteine, la cinetica enzimatica e le analisi biochimiche. Poiché i campioni in queste applicazioni non sono facilmente disponibili in grandi quantità, sono particolarmente adatti per essere analizzati in questa tecnica non distruttiva. Inoltre, il campione prezioso può essere salvato utilizzando una piattaforma di micro-volume in cui è richiesto solo 1uL di campione per analisi complete. Una breve spiegazione della procedura di spettrofotometria include il confronto dell’assorbenza di un campione vuoto che non contiene un composto colorato con un campione che contiene un composto colorato. Questa colorazione può essere realizzata da un colorante come Coomasie Brilliant Blue G-250 dye misurata a 595 nm o da una reazione enzimatica come visto tra β-galattosidasi e ONPG (giri campione giallo) misurata a 420 nm.: 21-119 Lo spettrofotometro è usato per misurare i composti colorati nella regione visibile di luce(fra 350 nanometro e 800 nanometro),: 65 così può essere usato per trovare più informazioni sulla sostanza che sta studiando. Negli esperimenti biochimici, viene scelta una proprietà chimica e/o fisica e la procedura utilizzata è specifica per quella proprietà al fine di ricavare maggiori informazioni sul campione, come la quantità, la purezza, l’attività enzimatica, ecc. La spettrofotometria può essere utilizzata per una serie di tecniche come la determinazione dell’assorbanza ottimale della lunghezza d’onda dei campioni, la determinazione del pH ottimale per l’assorbanza dei campioni, la determinazione delle concentrazioni di campioni sconosciuti e la determinazione del pKa di vari campioni.:21-119 La spettrofotometria è anche un processo utile per la purificazione delle proteine e può anche essere utilizzata come metodo per creare saggi ottici di un composto. I dati spettrofotometrici possono anche essere utilizzati in combinazione con l’equazione di Beer-Lambert, A = − log 10 T T = c c l = O D {\textstyle A=-\log _{10}T=\epsilon cl=OD}

, al fine di determinare varie relazioni tra trasmittanza e concentrazione e assorbanza e concentrazione.:21-119 Poiché uno spettrofotometro misura la lunghezza d’onda di un composto attraverso il suo colore, una sostanza legante colorante può essere aggiunta in modo che possa subire un cambiamento di colore ed essere misurata. È possibile conoscere le concentrazioni di una miscela bicomponente utilizzando gli spettri di assorbimento delle soluzioni standard di ciascun componente. Per fare ciò, è necessario conoscere il coefficiente di estinzione di questa miscela a due lunghezze d’onda e i coefficienti di estinzione delle soluzioni che contengono i pesi noti dei due componenti. Gli spettrofotometri sono stati sviluppati e migliorati nel corso di decenni e sono stati ampiamente utilizzati tra i chimici. Inoltre, gli spettrofotometri sono specializzati per misurare i valori di assorbanza della lunghezza d’onda della luce UV o visibile.: 21-119 È considerato uno strumento di grande precisione che è anche molto sensibile e quindi estremamente preciso, soprattutto nel determinare il cambiamento di colore. Questo metodo è anche conveniente per l’uso in esperimenti di laboratorio perché è un processo economico e relativamente semplice.