Figura 2. Influenza del modificatore di fase mobile sulla selettività della separazione. In alto, acetonitrile; in basso, metanolo. Colonna: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradiente a 2 ml min−1 oltre 15 min da 0 a 80% organico a pH 3 con formiato di ammonio. Analiti: 1, triamterene; 2, clortalidone; 3, althiazide; 4, furosemide; 5, benztiazide; 6, probenecid; 7, acido etacrinico; 8, bumetanide; 9, acido canrenoico. (Cromatogramma fornito da Diane Diehl e Kim Tran, Waters Corporation.)

L’interpretazione della selettività del solvente è complicata dal fatto che il solvente organico è adsorbito dai ligandi in fase stazionaria e può essere considerato parte della fase stazionaria. Recentemente, diversi autori hanno misurato l’eccesso superficiale dei modificatori organici per fasi stazionarie di tipo C18 standard e hanno riscontrato differenze significative nella solvatazione superficiale tra acetonitrile e metanolo.

È stato menzionato all’inizio di questa sezione che il metanolo fornisce una ritenzione maggiore rispetto all’acetonitrile. Questo è ancora più pronunciato per i composti ionizzati che per i composti non ionizzati. Ciò ha senso dal punto di vista che il metanolo adsorbito nella fase stazionaria facilita la penetrazione delle molecole ionizzate nella fase stazionaria. Lo stesso modello si trova quando il metanolo viene confrontato con il THF. Queste sono caratteristiche utili nello sviluppo del metodo. D’altra parte, i composti con gruppi funzionali sulfamidici mostrano relativamente più ritenzione nel THF, rispetto a un gruppo di analiti di riferimento. Nel complesso, si può osservare un’influenza significativa del solvente organico sulla selettività di una separazione, ma una razionalizzazione è difficile, poiché il solvente può essere trovato sia nella fase stazionaria che in quella mobile. Alcuni autori hanno anche tentato di distinguere le fasi mobili ad alto contenuto di acqua da quelle a basso contenuto di acqua.

Come accennato in precedenza, le importanti differenze di selettività tra i diversi solventi sono uno strumento molto utile nello sviluppo di separazioni a fase inversa. Gli schemi di sviluppo del metodo classico hanno utilizzato metanolo, acetonitrile e THF come modificatori organici nella fase mobile. Le selettività intermedie possono essere ottenute con miscele di solventi e una regolazione della spaziatura dei picchi può essere eseguita senza difficoltà. I moderni schemi di sviluppo del metodo utilizzano la temperatura come un’altra variabile facilmente controllabile nella regolazione della selettività.

Un aspetto importante della selettività della fase mobile è il suo pH. Il controllo della ritenzione di composti ionizzabili con l’aiuto di tamponi o additivi acidi o basici alla fase mobile è molto importante. Scegliendo giudiziosamente il pH in fase mobile, si può facilitare la manipolazione della ritenzione e della selettività. Come accennato in precedenza, la differenza di ritenzione tra la forma ionizzata e la forma non ionizzata di un analita può essere da 10 a 30 volte e il controllo del pH è importante.

Negli ultimi anni, la ricerca ha dimostrato che sia il pH che le costanti di ionizzazione del tampone vengono alterate, quando vengono aggiunti solventi organici. Ciò ha conseguenze importanti per il controllo della conservazione. Di solito si può arrivare ad una ionizzazione definita dell’analita se il pH della fase mobile è ±2 unità di pH lontano dal pKa dell’analita. Ma se il pH e l’analita pKa stanno entrambi cambiando con l’aggiunta di solvente organico, questo non è facile da affrontare usando semplici regole. Pertanto, un buon controllo del pH e un buon tampone sono elementi importanti della riproducibilità di una separazione a fase inversa di analiti ionizzabili. Il pH è misurato in acqua, dove si ha familiarità con i valori pKa dei buffer comunemente usati, e si preferisce stare vicino a questi valori pKa. La capacità massima del buffer si trova al pKa del buffer. Mentre il pH cambia in presenza del solvente organico, la capacità tampone no. Per il professionista della cromatografia a fase inversa, questo è un aspetto importante del controllo della ritenzione. D’altra parte, lo sperimentatore dei meccanismi di ritenzione in fase inversa deve essere preparato a misurare il pH in presenza del solvente organico per comprendere appieno la sua influenza sulla ritenzione. Tipicamente, l’aggiunta del solvente organico provoca un aumento del pKa degli acidi e una diminuzione del pKa per le basi. Questo vale sia per i buffer che per gli analiti. Ciò può comportare un cambiamento significativo nel modello di ionizzazione previsto di un analita. Ecco un esempio che illustra questo: un’ammina con un pKa di 9 è completamente ionizzata in un tampone fosfato a pH 7 in acqua, ma può essere solo metà ionizzata nello stesso tampone dopo l’aggiunta di metanolo al 70%. È chiaro che tali effetti sono significativi. Pertanto, un modo accurato per preparare un tampone e controllare il suo pH è vitale per un buon controllo della ritenzione in fase inversa degli analiti ionizzabili.

Altre interazioni ioniche influenzano anche la ritenzione e la selettività di una separazione di fase inversa di analiti ionizzati. Uno strumento classico per aumentare la ritenzione di analiti ionici è la cromatografia a coppia ionica. In questa tecnica, la fase stazionaria è equilibrata con uno ion carico idrofobo, come uno chain acido solfonico a catena lunga (ad esempio, ottilsolfonato) o un’ammina quaternaria idrofoba (ad esempio, lo tet tetrabutilammonio). Una tipica concentrazione di fase mobile è di circa 10 mm.L’aggiunta del reagente a coppia ionica alla fase mobile aumenta la ritenzione di ioni bersaglio, diminuisce la ritenzione di ioni della stessa carica del reagente a coppia ionica e lascia quasi inalterata la ritenzione di analiti neutri compresi gli zwitterioni. Quindi è uno strumento eccellente per regolare la selettività di una separazione. La ragione di questi cambiamenti nella selettività è il fatto che il reagente a coppia ionica viene adsorbito sulla superficie della fase stazionaria. L’interpretazione più semplice del meccanismo di ritenzione risultante è una combinazione di scambio ionico con il meccanismo a fase inversa. All’aumentare della concentrazione del reagente a coppia ionica nella fase mobile, la ritenzione di analiti caricati in modo opposto aumenta inizialmente e quindi si livella a concentrazioni più elevate. Per reagenti a coppia ionica con lunghezza della catena diversa, la ritenzione aumenta più rapidamente con una lunghezza della catena più lunga.

Un altro effetto di interazione ionica incontrato con analiti cationici è l’aumento della ritenzione quando piccoli contro ioni inorganici vengono aggiunti alla fase mobile. Le concentrazioni richieste sono in genere circa 10 volte superiori alle concentrazioni utilizzate con i reagenti a coppia ionica. Gli anioni tipici di questo tipo sono perclorato (ClO4−), tetrafluoroborato (BF4−) o esafluorofosfato (PF6−). Aumentano significativamente la ritenzione di analiti cationici. L’effetto è più pronunciato con acetonitrile come additivo in fase mobile rispetto al metanolo. Ciò è spiegato da uno strato più spesso di acetonitrile adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a uno strato monomolecolare di metanolo e dal partizionamento del contatore in questo strato. Dal punto di vista degli utenti, il comportamento di ritenzione degli analiti cationici in presenza di questi anioni inorganici non è dissimile da quello osservato con reagenti a coppia ionica vera, cioè con acidi solfonici a catena lunga.