Diagnosi

Diagnosi clinica: Quadro clinico dei pazienti affetti da infezione da clamidia potrebbe essere fuorviante come fino al 70-80 per cento delle donne infette e il 50 per cento degli uomini infetti sono asintomatici. In genere, una femmina con infezione da clamidia non complicata si presenterà con perdite vaginali mucoidi inodore senza prurito. Disuria senza frequenza o urgenza sarà lamentato se uretra è coinvolto. Inoltre, nella PID, può essere provocata una storia di forte dolore addominale con febbre alta, dispareunia, cicli mestruali prolungati e sanguinamento intermensturale. All’esame, la cervicite con una scarica gialla, torbida e mucoide può essere vista dal sistema operativo. La cervice tende a sanguinare facilmente quando raschiato con spatola o pennello. L’analisi delle urine rivelerà la presenza di > 5 WBC/HPF (high power field), che è indicativo di uretrite13. Le infezioni da clamidia non possono essere distinte clinicamente da altre infezioni uretrali. Prova dell’ammina (cioè, significativo rilascio di odore su aggiunta di KOH alla secrezione vaginale) può aiutare a differenziare le infezioni da clamidia da altre infezioni del tratto genitale inferiore, ma ha una bassa specificità.

L’infezione da clamidia nei maschi si manifesta come uretrite nel 15-55 per cento degli affetti inferiore o uguale a 35 anni, occasionalmente si può vedere l’epididimita2. Lieve a moderata chiaro a bianco scarico uretrale è visto al mattino prima che i vuoti del paziente. In epididimite, storia di dolore testicolare unilaterale con eritema scrotale, dolorabilità o gonfiore sopra l ” epididimo può essere suscitato. La diagnosi può essere stabilita dalla presenza di scarico mucopurulento dal pene che sulla colorazione Gram mostra > 5 WBC/HPF e assenza di diplococchi Gram negativi intracellulari. La sindrome di Reiter può essere una rara complicanza dell’infezione da clamidia non trattata. Un’artrite reattiva che include triade di uretrite / cervicite nelle femmine, conjuntivite e eruzione mucopurulenta indolore su palme e piante dei piedi è vista nella sindrome di Reiter29. Le femmine sono più comunemente colpite rispetto ai maschi. Ci sono coinvolgimenti articolari multipli asimmetrici con predilezione per gli arti inferiori.

Diagnosi di laboratorio: La natura asintomatica della malattia e l’aumento dello spettro di infezioni causate da C. trachomatis sottolineano la necessità di metodi di laboratorio sensibili e affidabili.

La competenza nella raccolta e nel trasporto dei campioni è fondamentale per la precisione nei test diagnostici. Sia la sensibilità che la specificità dei test diagnostici per C. trachomatis hanno dimostrato di essere direttamente correlate all’adeguatezza del campione. Le cellule ospiti che ospitano l’organismo dovrebbero essere incluse nella raccolta dei campioni in quanto le clamidie sono patogeni intracellulari obbligati, specialmente nelle tecniche che coinvolgono la visualizzazione diretta dell’organismo.

La scelta dei siti di campionamento può influenzare la probabilità di recuperare l’agente patogeno. È stato osservato un aumento del 10-20 per cento nel recupero di C. trachomatis dal tratto genitale se vengono prelevati campioni sia cervicali che uretrali rispetto al solo campionamento cervicale42. Il tampone endocervicale, il tampone vaginale / introitale, il tampone vulvale, il tampone uretrale e rettale e l’urina di prima cattura sono i campioni comuni prelevati dalle pazienti di sesso femminile. Il tampone uretrale e rettale e il primo campione di urina possono anche essere raccolti da pazienti maschi oltre ad altri campioni specifici come il liquido prostatico.

Garanzia di qualità della raccolta e del trasporto del campione: l’adeguatezza del campione può essere determinata dalla visualizzazione di cellule squamo-colonnari durante la microscopia. Un campione è considerato adeguato se contiene una cellula colonnare / metaplastica per vetrino. La probabilità di isolamento è ottimizzata se il campione viene refrigerato immediatamente dopo la raccolta a 2-8°C. Il tempo tra la raccolta del campione e la lavorazione dovrebbe idealmente essere inferiore a 48 h, se ciò non è possibile, questi possono essere congelati a -70 °C fino al processo16. Il siero bovino fetale (2-5%) contribuisce a conservare la vitalità di chlamydiae in esemplare, che deve essere congelato. Il fosfato di saccarosio a due molari (2-MSP) o il glutammato fosfato di saccarosio sono il mezzo di trasporto più comunemente usato. Mezzi di trasporto sintetici per la coltura e alcuni test non colturali sono stati sviluppati e approvati per uso diagnostico, ad esempio mezzo di trasporto M4, mezzo Flex Trans e nuovo mezzo sintetico/universale M4.

La diagnosi di laboratorio della clamidia consiste nei seguenti metodi:

(i) Test specifici

Coltura cellulare: L’isolamento dell’organismo è il metodo definitivo per la diagnosi dell’infezione da clamidia. La clamidia è un agente patogeno intracellulare obbligato e, pertanto, richiede linee cellulari embrionali di uova di gallina o animali per la coltura. Tali metodi di coltura sono tecnicamente difficili, laboriosi, ingombranti e costosi e non sono stati ampiamente adottati come test di routine eseguiti nei laboratori clinici generali. Tuttavia, tre sistemi in vitro sono stati utilizzati per la coltura di chlamydiae cioè. inoculazione del topo (intraperitoneale, intracranica e endovenosa), inoculazione del sacco vitellino (inoculazione del sacco vitellino dell’embrione di 7-8 giorni) e linee di coltura cellulare16. Le linee cellulari più comunemente utilizzate includono-cellule HeLa 229, cellule McCoy, cellule BHK21 e BGMK24.

La sensibilità della coltura cellulare per l’isolamento delle clamidie è migliorata dal pretrattamento della cellula mediante policazioni, DEAE-destrani, centrifugazione dell’inoculo sul monostrato cellulare e incorporazione di anti-metaboliti come cicloesimide o citocalasina B nel mezzo di coltura cellulare42. Il monostrato cellulare per la coltura di C. trachomatis viene coltivato in fiale a tamburo o guscio su coperchi di vetro o nei pozzetti di piatti di coltura cellulare multiwell. Il metodo della fiala shell è più sensibile per il campione clinico rispetto alla coltura cellulare multiwell a causa delle minori possibilità di contaminazione incrociata42. Prima dell’inoculazione, il campione deve essere sonicato per interrompere le cellule ospiti e per separare le inclusioni di clamidia. Per inoculare le colture cellulari, il mezzo di coltura sovrastante deve essere rimosso e sostituito con abbastanza campioni nel mezzo di trasporto della coltura per coprire il monostrato e prevenire l’essiccazione.

Il mezzo di crescita più comunemente usato è Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) integrato con aminoacidi e vitamine, siero di vitello fetale (5-10), glucosio extra (0,056 m) e 2-glutamine42. Dopo l’inoculazione, le colture vengono incubate a 37o C per 2-3 giorni. Le inclusioni clamidiali vengono quindi osservate mediante colorazione immunofluorescente. È stato dimostrato che la sensibilità dell’isolamento varia dal 70 all ‘ 85% a seconda del laboratorio e del sistema di coltura utilizzato. Tradizionalmente, questo è il “gold standard” per la diagnosi di C. trachomatis in quanto è 100 per cento specific42. Sfortunatamente, è al di là delle capacità della maggior parte dei laboratori privati e pubblici a causa della sua domanda tecnica, intensità di lavoro e costi elevati.

Prova fluorescente diretta (DFA): Il test DFA aggiunge il notevole vantaggio della colorazione anticorpale specifica per la clamidia all’esame diretto del campione e rimane una delle tecniche diagnostiche più utili. In questo test, viene utilizzata una rapida identificazione di corpi elementari in strisci con anticorpi monoclonali coniugati con isotiocinato di fluoresceina (FITC – Mab) contro MOMP o LPS specifici del genere. I corpi elementari appaiono come particelle distinte, nettamente delineate, verde mela, a forma di disco (300 nm) e i corpi reticolati appaiono circa tre volte più grandi dei corpi elementari con un alone fluorescente.

Questa procedura non richiede condizioni rigorose per il trasporto del campione in quanto viene preparato uno striscio laterale del letto e successivamente trasportato per la lavorazione. Con l’uso di MOMP di C. trachomatis la sensibilità e la specificità di DFA sono trovate per essere 80-90 per cento e 98-99 per cento, rispettivamente in relazione alla cultura43. L’elevata specificità del DFA è attribuita alla sua dipendenza dalla visualizzazione della morfologia distintiva e delle caratteristiche di colorazione delle inclusioni da clamidia. Il DFA è l’unico test diagnostico disponibile che consente la valutazione simultanea dell’adeguatezza del campione mediante la visualizzazione delle cellule epiteliali presenti nello striscio. È rapido e semplice (tempo di consegna circa 30 min) ma l’esame microscopico e l’interpretazione dei risultati richiedono esperienza. Questo metodo è, quindi, raccomandato per i laboratori a basso volume. Questo test può essere applicato anche ai siti extragenitali. È segnalato per essere più sensibile della coltura per il rilevamento della clamidia in campioni endometriali o tubali42.

ELISA (saggio immunoassorbente legato agli enzimi): ELISA è disponibile per la rilevazione dell’antigene di C. trachomatis. Diversi kit ELISA disponibili in commercio sono disponibili per lo scopo. La maggior parte di questi rileva LPS da clamidia che è più solubile di MOMP. È stato riportato che i test immunoenzimatici (VIA) hanno una sensibilità del 62-96% e una specificità dell ‘ 86-99% rispetto alla coltura cellulare44. Questo test è adatto per laboratori senza accesso alla coltura cellulare. Tuttavia,diversi studi grandi e piccoli in tutto il mondo,inclusa l’India, hanno riportato una scarsa sensibilità di ELISA rispetto a DFA e PCR45, 46, 47.

Citologia: la citologia è un test diagnostico facilmente disponibile, semplice da usare e conveniente. Non richiede precauzioni per la conservazione e il trasporto del campione e possono essere rilevate anche particelle non vitali/non infettive. La qualità del campione clinico può essere valutata con la tecnica microscopica e le procedure tecniche utilizzate in questi test sono solitamente più veloci e semplici da eseguire rispetto alla coltura. I metodi di colorazione Giemsa, immunoflourescence e iodio sono più comunemente usati. Altre macchie come immunoperossidasi, immunoferritina, May Grunwald, Giemenez, Macchiavello e acridina arancione possono anche essere utilizzate per rilevare l’inclusione di clamidia nelle cellule esfoliate. La presenza di inclusioni intracitoplasmatiche è patogonomica per le infezioni oculari da clamidia nei neonati, tuttavia, questo metodo non è raccomandato per diagnosticare la congiuntivite o l’infezione genitale negli adulti a causa della mancanza di sensibilità. Dei tre metodi, l’immunofluorescenza offre la più alta sensibilità seguita da Giemsa e poi da iodio che staining42.

Metodi molecolari: I metodi tradizionali di diagnosi hanno parecchie limitazioni che includono la sensibilità bassa, il tempo lungo di prova e l’alto costo. Pertanto, vengono ideati test basati sul riconoscimento diretto di sequenze di DNA e RNA. La sonda del DNA disponibile in commercio per la rilevazione di clamidia è la prova di PACE 2 (chemiluminescenza aumentata saggio della sonda) 48, capace di rilevazione delle gonorrhoeae di Neisseria inoltre, che è una sonda non isotopica del DNA per la rilevazione delle parti specifiche di r-RNA di C. trachomatis nell’esemplare endocervicale e uretrale. Un’altra sonda del DNA, la prova di PACE 2C inoltre è stata sviluppata che individua simultaneamente sia C. trachomatis che N. gonorrhoeae da un singolo esemplare; tuttavia, l’ulteriore valutazione di PACE 2C è richiesta prima del suo uso nella diagnostica. Queste prove impiegano una sonda chemiluminescente del DNA che ibrida ad una sequenza specie – specifica di clamidia 16S rRNA. Una volta formato l’ibrido DNA-rRNA, viene adsorbito su un tallone magnetico e la risposta chemiluminescente viene rilevata quantitativamente con un luminometro. Poiché la divisione attiva delle clamidie contiene fino a 104 copie di 16S rRNA, il test PACE 2 dovrebbe teoricamente essere più sensibile dei sistemi di rilevamento dell’antigene. La sensibilità di PACE 2 rispetto a uno standard di amplificazione del DNA non è stata ancora ben valutata, ma è stata riportata da 77 a 93 per cent48 in uno studio.

Lo sviluppo di test basati sulla tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) è stato il progresso più importante nel campo della diagnosi da clamidia poiché le tecniche di coltura cellulare in vitro hanno sostituito il sacco vitellino per la coltura e l’isolamento dell’organismo da campioni clinici. NAAT è almeno il 20-30 per cento più sensibile (in grado di rilevare un minimo di una singola copia del gene) e il 100 per cento specifico49,50. Offre l’opportunità di utilizzare campioni non invasivi come l’urina per esaminare le infezioni in individui asintomatici che normalmente non cercano cure cliniche. Questo è un vantaggio critico, poiché la maggior parte delle infezioni da clamidia nelle donne e una percentuale significativa di infezioni negli uomini sono asintomatiche. La più nota delle tecnologie di amplificazione del DNA è la PCR. La PCR può essere genere, specie, gruppo o ceppo specifico a seconda del design del primer. I geni mirati per la diagnosi di C. trachomatis sono il gene MOMP, il plasmide endogeno, il gene della fosfolipasi e il gene rRNA 16S e 23S. Poiché tutte le tecnologie di amplificazione degli acidi nucleici rilevano bersagli di acidi nucleici, questi non dipendono né dalla vitalità né da uno stato intatto dell’organismo bersaglio per un risultato positivo. Pertanto, il trasporto del campione non è un problema critico49. Anche se non è stato ben studiato, la “finestra” per la cultura-negativo, PCR stato positivo dopo la terapia con doxiciclina sembra durare fino a 3 wk29. Dopo questo tempo, i campioni dei pazienti diventano negativi sia per la coltura che per la PCR.

Il test PCR per il rilevamento di C. trachomatis sviluppato da Roche Diagnostics, Basilea Svizzera (Roche-Amplicor) è stato il primo test PCR approvato dalla FDA negli Stati Uniti51. Dal 1993, la PCR di Amplicor è stata valutata relativamente bene sia per i campioni urogenitali che per quelli urinari, con una sensibilità e specificità complessive del 90 e del 99-100 per cento, rispettivamente51. Amplicor PCR è approvato per campioni uretrali cervicali, maschili e maschili.

Con l’esplosione delle tecniche di biologia molecolare più recenti saggi come il sistema m2000 (Abbott) così come strand-displacement amplification (SDA) (BD ProbeTec strand displacement amplification sviluppato da Becton Dickinson and Company, Diagnostic Systems, Franklin Lakes, N. J.) e transcription-mediated amplification (TMA) (APTIMA system di Gen-Probe, Inc., San Diego) divenne disponibile per C. trachomatis. Anche se popolare nei paesi sviluppati, il loro alto costo iniziale e di manutenzione impediscono il loro uso in ambienti poveri di risorse.

L’onere di C. gli organismi trachomatis nel tratto genitale (carico chlamydiale) possono essere rilevati mediante PCR quantitativa in tempo reale e possono variare da 10 a oltre un milione di organismi/ml di secrezioni del tratto genitale52. È probabile che ciò influenzi le prestazioni di diversi test di amplificazione dell’acido nucleico, che non distinguono abitualmente tra persone con carichi alti e bassi da clamidia. È stato riportato che le differenze nel carico clamidiale sono associate alla presenza di sintomi clinici, alla trasmissibilità e alla persistenza dell’infezione e al rischio di sviluppare sequele croniche53. Quindi, c’è un ruolo critico di quantificazione nella diagnosi e nel trattamento delle infezioni da clamidia.

I NAAT sono i test più sensibili per lo screening e la diagnosi delle infezioni da clamidia e gonococciche del tratto genitale54,55,56. Tuttavia, vengono segnalati dubbi sulla loro performance nelle aree a bassa prevalenza 57,58. Nel 2002, il CDC ha raccomandato di confermare tutti i NAAT positivi per C. trachomatis quando il valore predittivo positivo del test è < 90 per cent59. Tuttavia, le vere specificità dei metodi NAAT sono risultate essere > 99 per cent54,55.

Il CDC ha anche suggerito alcune possibili strategie per confirmation59 che sono: (i) il test di un secondo esemplare con un diverso NAAT aventi uguale o maggiore sensibilità per la prima prova, (ii) esecuzione di un diverso NAAT aventi uguale o maggiore sensibilità per il primo test di targeting una diversa sequenza di acido nucleico sul campione originale, (iii) di ripetere l’originale test sul campione originale, e (iv) che portano il paziente torna per un nuovo test.

Tuttavia, le limitazioni descritte sono che la maggior parte dei medici non raccoglierà due campioni per la stessa valutazione, né è fattibile riportare il paziente a raccogliere un altro campione, e la maggior parte dei laboratori non ha le strutture / capacità per eseguire due NAAT diversi.

Il concetto di test di conferma non è nuovo57. Tuttavia; complica la gestione di un campione positivo NAAT e aggiunge costi a un test di screening già costoso. Inoltre, c’è ancora spazio per migliorare la sensibilità dei NAATs, forse con una migliore preparazione del campione, automazione o concentrazione target.

(ii) Test non specifici

Il test dell’esterasi leucocitaria (LE) è un test rapido dell’astina di livello da utilizzare con campioni di urina. Questo test è progettato per rilevare le infezioni del tratto urinario rilevando l’enzima prodotto dalle cellule polimorfonucleate (PMN). I risultati positivi del test LE si verificano con infezioni causate da un numero di agenti diversi tra cui C. trachomatis e N. gonorrhoeae.

La sensibilità del test LE per la rilevazione dell’infezione da C. trachomatis varia ampiamente dal 31 al 100% e le specificità variano dall ‘ 83 al 100% 60. Il test LE è stato considerato il miglior test di screening per i maschi adolescenti e, secondo la maggior parte dei rapporti, non dovrebbe essere utilizzato per testare campioni di donne o uomini anziani a causa di prestazioni insoddisfacenti.

(iii) Test rapidi point of care (POC)

I test rapidi, chiamati anche test “point-of-care” per C. trachomatis impiegano la tecnologia EIA in formati basati principalmente sulla cattura della membrana o sull’immunodiffusione del lattice. I test rapidi vengono eseguiti negli uffici del medico, non richiedono attrezzature sofisticate e possono essere completati in circa 30 min. I risultati vengono letti visivamente e sono quindi qualitativi. Anche se diversi kit sono disponibili in commercio, ma nessuno è stato ben valutato. In generale, i test rapidi sono significativamente meno sensibili e specifici di quelli eseguiti in laboratorio. Rispetto alla PCR, la sensibilità e la specificità del test Clearview (Unipath Ltd., UK) erano 53.8 e 99.1 per cento, rispettivamente, con campioni di tampone endocervicale, e 31.1 e 95.2 per cento con campioni di tampone vaginale da donne filippine61. I test rapidi offrono un vantaggio rispetto ai test di laboratorio convenzionali solo quando i risultati sono necessari immediatamente per la gestione del paziente. I test rapidi non devono essere utilizzati in una popolazione a bassa prevalenza o in individui asintomatici a causa del potenziale di risultati falsi positivi. I risultati di un test rapido devono sempre essere considerati presuntivi e, se positivi, devono essere confermati da un test eseguito in laboratorio.

In conclusione, sebbene la coltura sia specifica al 100%, la sua sensibilità stimata può arrivare fino al 50%. La maggior parte dei laboratori si è allontanata dalla cultura a causa delle spese, del tempo e delle difficoltà tecniche. Pertanto, invece della cultura come gold standard diagnostico, il gold standard espanso/standard di riferimento definito, cioè un risultato comunemente coerente con due tecniche non colturali è considerato utile come strumento di ricerca43.

(iv) Sierologia

I test sierologici non sono generalmente utili nella diagnosi delle infezioni del tratto genitale causate da C. trachomatis. Anticorpi provocati da C. l’infezione da trachomatis è di lunga durata e un test anticorpale positivo non distinguerà un precedente da un’infezione corrente.