Milano e altre cinque città resistettero, e nell’ottobre del 1238 dovette sollevare l’assedio di Brescia. Nello stesso anno il matrimonio del figlio naturale di Federico Enzio con la principessa sarda Adelasia e la designazione di Enzio come re di Sardegna, in cui il papato rivendicava la sovranità, portarono alla rottura definitiva con il papa. Gregorio IX diffidava profondamente di Federico sia in materia religiosa che politica: Federico avrebbe dovuto scherzare sul fatto che Mosè, Cristo e Maometto erano tre impostori che erano stati essi stessi ingannati, e nell’arena politica il papa temeva che lo Stato Pontificio stesse per essere isolato e circondato, in particolare perché a Roma si era formato un partito filo-imperiale. Con il pretesto che l’imperatore intendeva cacciarlo da Roma, Gregorio scomunicò Federico per la seconda volta la domenica delle Palme, il 20 marzo 1239. Questo fu l’inizio dell’ultima fase della gigantesca lotta tra il papato e l’impero; finì con la morte dell’imperatore e la caduta della sua casa.

Federico contrastò la scomunica con una serie di manifesti importanti, la maggior parte dei quali composti da Pietro della Vigna, membro della cancelleria imperiale, che aveva notevoli doti letterarie. Il manifesto sottolineava che i cardinali dovevano partecipare alla guida della chiesa, e Federico cercò persino di evocare la solidarietà tra i principi secolari. Egli ha anche, tuttavia, intensificato le sue attività militari nel nord Italia. Per finanziare il suo crescente bisogno di armi, istituì una profonda riorganizzazione amministrativa dell’Italia imperiale (tra le altre, la formazione di 10 vice reggenze) e del Regno di Sicilia. Inoltre, ha decretato la rigorosa sorveglianza della popolazione. Nell’Italia centrale prese l’offensiva, occupando la marcia di Ancona e il Ducato di Spoleto, e nel febbraio 1240 il suo esercito marciò verso lo Stato Pontificio e minacciò Roma. All’ultimo momento, però, il papa ottenne il sostegno dei Romani.

A seguito della sconfitta di una flotta genovese che portava delegati per un concilio papale a Roma, più di 100 ecclesiastici di alto rango-tra cui cardinali e vescovi—furono presi come prigionieri di Federico in Puglia. Questa vittoria militare si rivelò, tuttavia, uno svantaggio politico: fornì materiale per la propaganda che descriveva Federico come un oppressore della chiesa.

Mentre era ancora accampato davanti a Roma, Federico ricevette la notizia della morte di papa Gregorio e si ritirò in Sicilia. Nel frattempo, i mongoli avevano invaso l’Europa. Furono temporaneamente fermati nella sanguinosa battaglia di Liegnitz in Slesia il 9 aprile 1241, ma probabilmente solo la morte improvvisa del loro capo, il gran khan Ögödei, impedì ulteriori progressi mongoli in quel momento.

Il breve pontificato di Celestino IV fu seguito da un lungo interregno. Quando nel 1243 Innocenzo IV fu eletto, Federico, su sollecitazione dei principi tedeschi e del re Luigi IX di Francia, aprì le trattative con il nuovo papa. L’accordo tra il papa e l’imperatore sembrava vicino sull’evacuazione dello Stato Pontificio, quando nel giugno 1244 Innocenzo fuggì dalla città. A Lione convocò un concilio per il 1245 e nel luglio dello stesso anno depose l’imperatore, l’ostacolo alla riconciliazione sembra essere lo status dei comuni lombardi.

La battaglia tra l’imperatore e il papato infuriò quindi in piena furia. Da parte papale l’imperatore è stato bollato come il precursore del anti-Cristo; da parte imperiale è stato salutato come un messia. L’imperatore sostenne la richiesta contemporanea che la chiesa tornasse alla povertà e alla santità della prima comunità cristiana e fece nuovamente appello ai principi d’Europa affinché si unissero in una lega difensiva contro i prelati assetati di potere. La maggior parte dei principi, tuttavia, rimase neutrale, e, anche se due successivi antibings tedeschi ricevettero poco sostegno, l’imperatore perse costantemente terreno in Germania.

Nel maggio del 1247 il viaggio programmato di Federico a Lione per perorare la propria causa davanti al concilio pontificio fu interrotto dalla rivolta della città di Parma, in posizione strategica. Sulla scia di questa debacle gran parte dell’Italia centrale e della Romagna fu persa. L’anno successivo l’imperatore subì ulteriori colpi del destino; Pietro della Vigna, per molti anni confidente dell’imperatore, fu accusato di tradimento e si suicidò in carcere. Nel maggio del 1249 il re Enzio di Sardegna, figlio prediletto di Federico, fu catturato dai Bolognesi e tenuto in carcere fino alla sua morte nel 1272.

La posizione dell’imperatore, sia in Italia che—grazie agli sforzi del figlio Corrado IV—in Germania, stava migliorando quando morì inaspettatamente nel 1250. Fu sepolto nella cattedrale di Palermo vicino alla sua prima moglie, ai suoi genitori e al nonno normanno.

Quando fu pubblicata la notizia della sua morte, tutta l’Europa fu profondamente scossa. Sorsero dubbi sul fatto che fosse davvero morto; i falsi Fredericks apparvero ovunque; in Sicilia crebbe una leggenda che era stato trasportato al vulcano Aetna; in Germania che era stato incapsulato in una montagna e sarebbe tornato come imperatore degli ultimi giorni per punire la chiesa mondana e ristabilire pacificamente il Sacro Romano Impero. Eppure si pensava che continuasse a vivere nei suoi eredi. In realtà, però, entro 22 anni dalla sua morte, erano tutti morti: vittime della battaglia con il papato che il loro padre aveva iniziato.