La via di Embden–Meyerhof–Parnas

La glicolisi può essere ampiamente definita come una via che produce energia che si traduce nella scissione di un esoso (glucosio) in un triosio (piruvato). Sebbene il termine sia spesso considerato sinonimo della via Embden–Meyerhof–Parnas (EMP), esistono altre vie glicolitiche, tra cui la via Entner–Doudoroff che procede attraverso un intermedio dell’acido gluconico e un complesso insieme di riarrangiamenti che procedono attraverso un intermedio pentoso (Figura 1).

Figura 1. Le vie glicolitiche di Escherichia coli. La via più lontana a sinistra è la via Emden-Meyerhof-Parnas; quella più lontana a destra è la via Entner-Doudoroff. I geni che codificano per i principali enzimi delle vie sono mostrati in corsivo. Le frecce in grassetto indicano la produzione o il consumo di legami ad alta energia (sotto forma di ATP o PEP) o la riduzione della potenza (come NADH o NADPH). La linea curva e audace vicino alla parte superiore della figura rappresenta la membrana citoplasmatica; le reazioni al di sopra di quella linea curva si verificano nel periplasma, quelle al di sotto si verificano nel citoplasma.

La via EMP è presente negli organismi di ogni ramo dei batteri, archaea ed eukarya. Chiaramente, questo è un adattamento evolutivo precoce, probabilmente presente nell’antenato di tutte le forme di vita attuali. Ciò suggerisce che la via EMP si è evoluta in un mondo anaerobico e fermentativo. Tuttavia, il percorso funziona anche in modo efficiente come base per la respirazione aerobica del glucosio. Le differenze tra fermentazione e respirazione risiedono in gran parte nei diversi destini del piruvato prodotto (vedi più avanti). Per semplicità, questa discussione si concentra sul percorso EMP nel noto batterio Escherichia coli, sebbene le caratteristiche di base del percorso siano quasi universali.

Prima che inizi il metabolismo del glucosio, deve essere trasportato nella cellula e fosforilato. In E. coli, questi due processi sono intimamente accoppiati in modo tale che il glucosio è fosforilato dal sistema della fosfotransferasi (PTS) mentre passa nella cellula. Poiché il glucosio-6-fosfato (G-6-P), come la maggior parte se non tutti i fosfati di zucchero, è tossico ad alte concentrazioni cellulari, questo processo di trasporto è strettamente regolato. La trascrizione del gene trasportatore glucosio-specifico, ptsG, è massima solo quando si accumula l’adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (limitazione dell’energia di segnalazione). Inoltre, la traduzione dell’RNA messaggero ptsG (mRNA) è inibita dal piccolo RNA sgrS, che viene prodotto quando si accumula G-6-P. Pertanto, l’importazione e la concomitante fosforilazione di G-6-P si riducono ogni volta che la domanda di più energia è bassa o la concentrazione di G-6-P è pericolosamente alta.

In assenza di una proteina PtsG, altri trasportatori collegati al PTS, in particolare il trasportatore specifico del mannosio, ManXYZ, possono anche trasportare e fosforilare il glucosio. Tuttavia, i mutanti ptsG crescono più lentamente sul glucosio rispetto ai ceppi wild-type. Il glucosio libero può anche accumularsi intracellulare dalla degradazione di oligosaccaridi contenenti glucosio come lattosio o maltosio. L’ingresso del glucosio intracellulare nella via EMP avviene tramite un’esochinasi codificata dal gene glk.

I due passaggi successivi nella via EMP preparano il G-6-P per la scissione in due fosfati di triosio. In primo luogo, una isomerasi fosfoglucosio reversibile (gene igp) converte G-6-P in fruttosio-6-fosfato. Un mutante igp può ancora crescere lentamente sul glucosio utilizzando altre vie glicolitiche (vedi più avanti), ma la via EMP è bloccata in un mutante igp. Il fruttosio-6-fosfato risultante viene ulteriormente fosforilato nella posizione C1 a fruttosio-1,6, – bifosfato a scapito dell’adenosina trifosfato (ATP) da una fosfofruttochinasi codificata da pfkA. Un secondo isozima minore di fosfofruttochinasi codificato da pfkB consente una crescita lenta dei mutanti pfkA. Un insieme potenzialmente concorrente di fosfatasi che rimuovono il fosfato C1 dalla funzione fruttosio-1,6, – bifosfato durante la gluconeogenesi, ma sono controllati durante la glicolisi da una varietà di meccanismi di feedback per prevenire inutili cicli.

La reazione successiva nella via è la scissione del fruttosio-1,6-bisfosfato a due triosi fosfati che dà il nome alla via (glicolisi = rottura dello zucchero). Questa reazione reversibile viene effettuata dal fruttosio bifosfato aldolasi (gene fbaA) e produce diidrossiacetone fosfato (DHAP) e gliceraldeide fosfato (GAP) come prodotti. Una seconda aldolasi non correlata (gene fbaB) viene prodotta solo durante la gluconeogenesi e quindi non svolge alcun ruolo nella glicolisi. I due fosfati di triosio sono liberamente interconvertibili tramite triosefosfato isomerasi (gene tpi). DHAP è un substrato chiave per la biosintesi lipidica. GAP è un nodo importante nella glicolisi; altre due vie glicolitiche comuni (vedi sotto) si uniscono alla via EMP a GAP.

Fino a questo punto, la via EMP può essere considerata come una via biosintetica poiché produce tre blocchi fondamentali biosintetici (G-6-P, fruttosio-6-fosfato e DHAP) a scapito dell’ATP e senza passaggi ossidativi. Il passo successivo è la fosforilazione ossidativa del GAP in acido 1,3-difosfoglicerico, un composto ad alta energia. L’incorporazione di fosfato inorganico da GAP deidrogenasi (gene gapA) è accoppiato alla riduzione di NAD+ a NADH. In condizioni aerobiche, questo NADH viene riossidato utilizzando la catena respiratoria per produrre ATP. In condizioni anaerobiche, questo NADH viene riossidato accoppiandosi alla riduzione di prodotti derivati dal piruvato o da altri intermedi della via EMP. L’enzima fosfoglicerato chinasi (gene pgk) quindi fosforila l’adenosina difosfato (ADP) in ATP a scapito del fosfato C1 di 1,3-difosfoglicerato. Questa è la prima delle due fosforilazioni a livello di substrato in cui il fosfato viene trasferito da un substrato altamente reattivo direttamente all’ADP senza il coinvolgimento della membrana ATP sintasi.

I prossimi due passaggi riorganizzano il 3-fosfoglicerato risultante all’ultimo intermedio ad alta energia della via, il fosfoenolpiruvato (PEP). In primo luogo, il fosfato viene trasferito dalla posizione C3 alla posizione C2 da una fosfoglicerato mutasi. Esistono due isoenzimi evolutivamente non correlati, uno dei quali (codificato dal gene gpmA) richiede un 2,3-bisfosfoglicerato come cofattore e l’altro (gene gpmM) no. Anche se E. coli, Bacillus subtilis, e alcuni altri batteri hanno entrambi isozimi, molti organismi hanno solo uno o l’altro. Ad esempio, il lievito Saccharomyces cerevisiae, il batterio Mycobacterium tuberculosis e tutti i vertebrati hanno solo l’enzima cofattore-dipendente, mentre le piante superiori, l’archaea e il batterio Pseudomonas syringae hanno solo l’enzima cofattore-indipendente. Un terzo isozima (gene ytjC) sembra esistere in E. coli, anche se il suo ruolo è meno chiaro.

Il 2-fosfoglicerato riorganizzato viene quindi disidratato da un’enolasi (gene en) per produrre l’intermedio chiave, PEP. Sebbene il piruvato sia generalmente considerato il prodotto finale della via EMP, si può sostenere che il PEP condivide tale onore. PEP è l’ultima fonte di fosfato per il trasporto/fosforilazione mediata da PtsG del glucosio che avvia la via. Inoltre, l’enzima enolasi è una parte necessaria del degradasoma che funziona con il piccolo RNA sgrS (descritto in precedenza) per inibire la traduzione dell’mRNA ptsG e stimolare la degradazione dell’mRNA ptsG. Ciò riduce la generazione dell’accumulo altrimenti tossico di G-6-P.

Vale la pena notare che il PEP è un punto di diramazione sia in condizioni aerobiche che anaerobiche. La carbossilazione del PEP mediante PEP carbossilasi (gene ppc) fornisce ossaloacetato, che si condensa con l’acetil-CoA derivato dal piruvato per formare citrato per eseguire sia il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) che lo shunt gliossilato aerobicamente. Durante la fermentazione, questo stesso ossaloacetato è un intermedio nella via riduttiva (rigenerante NAD) per succinare. Inoltre, l’ossaloacetato derivato dal PEP viene utilizzato (tramite una parte del ciclo TCA) per la biosintesi dell’acido glutammico anche in condizioni anaerobiche.

L’ultima reazione è una fosforilazione a livello di substrato di ADP in ATP a scapito del PEP per produrre piruvato. I due isozimi della piruvato chinasi (geni pykA e pykF) sono attivati dai fosfati di zucchero e il prodotto del gene pykF mostra una cooperatività positiva rispetto al substrato PEP, tendendo nuovamente a prevenire l’accumulo di questo intermedio fosforilato e impedendo così la generazione di più G-6-P attraverso il meccanismo di trasporto PtsG PEP-dipendente.

Alla fine della via EMP, 1 mol di glucosio viene convertito in 2 mol di piruvato, che può essere utilizzato per un ulteriore catabolismo o per la biosintesi. Produce anche 2 mol di ATP e 2 mol di NADH (che deve essere riossidato affinché il percorso continui a funzionare). Poiché il percorso genera diversi intermedi tossici, non sorprende che il flusso attraverso il percorso sia strettamente regolato. Gli enzimi della via rispondono rapidamente alle variazioni dell’offerta e della domanda mediante inibizione del feedback e attivazione del substrato delle attività enzimatiche. Rispondono anche (più lentamente) attraverso la regolazione trascrizionale dell’espressione genica in risposta ai regolatori globali che variano da organismo a organismo.

La via EMP funziona per generare sia intermedi biosintetici che energia catabolica dal glucosio. Tuttavia, serve anche come linea di tronco centrale in cui si alimentano molti altri percorsi catabolici. G-6-P, fruttosio-6-fosfato, DHAP e GAP sono punti di giunzione comuni in cui le vie cataboliche per zuccheri, alcoli, grassi e acidi organici si alimentano nella via EMP.