materiale Vegetale

Osservazioni e le analisi chimiche sono state condotte dal 2011 al 2018 su un insieme di piante coltivate nel giardino sperimentale presso l’Università di Louvain-la-Neuve campus (50°39’55″N; 4°37’11″E). Prima e durante il periodo di fioritura (luglio–agosto) le piante sono state collocate nelle camere di crescita dell’Università in condizioni controllate (24/22 °C; 16 L:8D, RH 80 ± 10%).

Materiale per insetti

Le principali specie di insetti visitatori di A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum e B. terrestris) sono state utilizzate in prove di attrattiva floreale e preferenza gustativa. Gli individui di A. mellifera e B. pascuorum (10 per test e trattamento) sono stati raccolti in natura intorno al campus universitario (minimo di quattro posizioni per specie) al mattino prima dei test. Come B. gli individui di terrestris non possono essere facilmente distinti nel campo (morfologia simile per diverse specie), abbiamo usato bombi da quattro alveari (Biobest, Westerloo, Belgio) collocati nelle vicinanze degli edifici universitari per ottenere individui per la sperimentazione.

Tratti floreali

Conta dei pollini

Le antere di 10 fiori nelle fasi maschile e femminile sono state raccolte, contate, essiccate e poste su un setaccio (90 µm) per essere strofinate per raccogliere i grani di polline. La quantità di grani di polline è stata pesata. La conta dei pollini è stata eseguita presso l’Università Lille-1 (Unità Evo-Eco-Paleo). Abbiamo usato un contatore di particelle per stimare il numero di grani di polline in questi campioni. Il giorno prima del conteggio dei pollini, i campioni sono stati collocati in un riscaldatore a tubi fino a quando la maggior parte dell’etanolo è evaporata. Abbiamo quindi forzato la deiscenza delle antere mettendo i campioni in un forno a 56 °C durante la notte. Abbiamo aggiunto 1 ml di acqua distillata a ciascun campione di polline. I tubi sono stati poi sonicati e vortexati per separare i grani di polline dalle antere e l’un l’altro. La soluzione di polline (200 µL) è stata quindi diluita in 5 ml di tampone di misurazione isotonica (CASY® ton). Il contatore di particelle ha analizzato tre campioni da 400 µL dalla sospensione di polline, fornendo il conteggio totale delle particelle in questo volume di 1200 µL, nonché conteggi per 400 classi di dimensioni che vanno da 0,125 a 150 µm. I confronti con campioni in bianco ci hanno permesso di identificare picchi di particelle, con dimensioni che vanno da 20 a 30 µm, che corrispondono ai grani di polline. Il numero di grani di polline per antera è stato stimato moltiplicando i valori forniti dal contatore di particelle per il rapporto di diluizione (es. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Colore e morfologia dei fiori

Abbiamo misurato i tratti floreali (lunghezza corolla, diametro corolla, colore floreale e riflettanza UV) su 10 fiori per fase (da 10 individui diversi). La larghezza del casco, la lunghezza della corolla e il diametro sono stati misurati con una pinza. Abbiamo misurato lo spettro di riflettanza del colore tepal utilizzando uno spettrometro a fibre ottiche (Avaspec-ULS2048) e una sorgente di luce pulsata allo xeno (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Paesi Bassi). Per le misurazioni della riflettanza UV, i fiori sono stati fissati su uno sfondo nero e fotografati con una Nikon D40 (ottica costiera 60 mm 1:4 ApoMacro UV-VIS-IR; Filtro X-Nite 330).

Floral volatile collection

Abbiamo campionato composti organici volatili (VOC) da fiori intatti di fase maschile e femminile (N = 4 per ogni fase). Ogni fiore è stato inserito singolarmente in un bulbo di vetro (lunghezza 50 mm e diametro 30 mm), con un’apertura di 17 mm di diametro. Per evitare la contaminazione dell’aria, un tubo di teflon riempito con carbone attivo è stato collegato a un’estremità del bulbo di vetro e due tubi Tenax TA di vetro (6 mm × 4 mm, 7 pollici; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgio) sono stati collegati all’altra estremità. I tubi Tenax sono stati collegati a pompe ad aria calibrate (Gilair plus, Sensidyn, San Pietroburgo, USA) ad una portata di 50 mL·min−1 per 180 min (tra le 11:00 e le 14:00 h). Le condizioni di laboratorio variavano tra 21,5 e 23,5 °C con 45-55% di umidità relativa.

I COV intrappolati sono stati quindi desorbiti termicamente su un gascromatografo Agilent 6800 dotato di un’unità di termodesorbimento Gerstel TDU e criocooler CIS mantenuto a -50 °C. Subito dopo il termodesorbimento, l’unità CIS T° è stata programmata da -50 °C a 300 °C a 12 °C sec−1. L’apparato GLC era accoppiato ad uno spettrometro di massa Agilent 7975 C. Le condizioni analitiche erano le seguenti: iniezione in modalità split (con rapporto di split di 50:1, elio a 1,6 mL min−1 come gas vettore), VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) colonna (Agilent). Il programma di temperatura che consente la migliore separazione (prove preliminari non mostrate) è stato fissato come segue: 40 °C (5 min) poi a 75 °C a 4 °C min−1 e a 115 °C (3 °C min−1) e infine a 250 °C a 13 °C min−1. Le condizioni dello SM erano le seguenti: Modalità EI a 70 eV, sorgente T ° = 250 ° C, MS quadrupolo a 200 ° C e intervallo di massa scansionato da 35 a 500 amu.

I cromatogrammi registrati sono stati sistematicamente interpretati per cercare VOC specifici per fasi maschili o femminili. Una volta rilevate, le molecole sono state identificate in base a database calcolati (Wiley 250.L e PAL 600). Le identificazioni sono state corroborate sulla base dei dati di conservazione delle molecole pure disponibili in commercio. Sono stati anche quantificati rispetto allo standard interno altamente puro (limonene, soluzione di metanolo 1 µL a 0.67 µg µL1 aggiunti automaticamente a ciascun tubo di desorbimento prima del processo termico).

L’aria ambiente è stata anche raccolta come controllo per identificare i contaminanti di fondo. Per evitare una possibile rottura, una seconda cartuccia di vetro caricata con lo stesso adsorbente (Tenax TA) è stata sistematicamente posizionata in tandem. L’analisi non ha rivelato alcuna traccia delle molecole di interesse.

Raccolta e analisi degli alcaloidi

Le antere sono state raccolte da 50 fiori (da 10 individui), essiccate e poi schiacciate su un setaccio (90 µm) per raccogliere i grani di polline. Tre repliche di 15 mg di polline sono state campionate per gli alcaloidi. I campioni sono stati congelati (-80 °C) per 2 h e poi liofilizzati. I campioni secchi sono stati macinati in una polvere fine con azoto liquido e quantità pesate di polvere sono state poste in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml (Eppendorf, Amburgo, Germania). Gli alcaloidi sono stati estratti utilizzando un omogeneizzatore tissutale (VWR Ultrasonic Cleaner) per 10 min in 100 µL di tampone di estrazione (metanolo acquoso al 70% e acido formico allo 0,5%). Dopo centrifugazione a 12.000 giri / min per 5 min (Centrifuga 5430 R), il surnatante è stato trasferito in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Dopo l’essiccazione in uno SpeedVac, gli alcaloidi sono stati risospesi in 200 µL di metanolo di grado LC-MS e filtrati con un filtro a siringa PTFE da 0,45 µm (Whatman).

Il nettare è stato raccolto in tubi capillari di vetro da 5 µL (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germania) da 50 fiori (da 10 individui). Tre repliche di 15 µL di nettare sono state essiccate in uno SpeedVac e risospese in 200 µL di metanolo di grado LC-MS prima della filtrazione con un filtro a siringa in PTFE da 0,45 µm (Whatman).

Le analisi chimiche sono state eseguite utilizzando un sistema LC-MS / MS costituito da una pompa Thermo Accela, un autocampionatore, un rilevatore di array di fotodiodi e un rilevatore di massa Thermo Scientific LTQ orbitrap XL (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgio). È stata utilizzata una colonna Phenomenex Gemini C18 (2 mm × 150 mm, confezionata con particelle 3-µm). È stato utilizzato un sistema di solventi binari con una portata di 300 µL min−1: solvente A, acqua di grado HPLC (acido formico allo 0,1%); e solvente B, metanolo di grado LC-MS (0 min: 95% A, 10-12 min: 0% A, 13-17 min: 95% A). È stato iniettato un volume di 10 µL e la temperatura della colonna è stata impostata a 30 °C. La MS ad alta risoluzione è stata eseguita con una sorgente di ionizzazione elettrospray in modalità positiva. Sono state applicate le seguenti condizioni di ingresso: temperatura capillare, 275 °C; tensione capillare, 13 V; lente del tubo, 140 V; flusso di gas guaina, 30 a.u.; e flusso di gas ausiliario, 10 u.a. L’acquisizione e l’elaborazione dei dati sono state eseguite con il software Xcalibur. Questo metodo copriva l’intervallo di massa di tutti gli alcaloidi (MW da 329 a 673). Alcaloidi da polline e nettare sono stati rilevati e provvisoriamente identificati da MS ad alta risoluzione. La frammentazione ottenuta dalla dissociazione indotta dalla collisione ha aiutato nell’identificazione. Le concentrazioni di alcaloidi sono state calcolate sulla base di una curva standard di aconitina in MeOH ed espresse come “equivalente aconitina”. Gli alcaloidi analizzati sono stati selezionati in base alla loro presenza in altre specie di aconito4,8.

Produzione di nettare e composizione di zucchero

Il nettare è stato raccolto in tubi capillari di vetro da 5 µL (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Germania) dai fiori delle piante trasferite nelle camere di crescita del campus universitario (nessuna visita di insetti). Abbiamo stimato l’andamento della produzione di nettare durante il giorno all’inizio dell’antesi campionando 2 fiori da 12 individui ogni 2 ore per 10 ore. Abbiamo anche misurato la produzione totale di nettare per fiore (2 fiori da 12 individui) per gli stessi fiori ogni 2 giorni durante l’intera durata della vita del fiore (9 giorni), alla stessa ora ogni giorno, 2 ore dopo l’accensione della luce. La produzione totale per le fasi maschili e femminili è stata stimata dal campionamento alla fine delle fasi maschili (5 giorni dopo l’antesi) e femminili (8 giorni).

I campioni di nettare sono stati conservati a -80 °C fino all’esecuzione di analisi chimiche. Dopo la derivazione, l’identificazione e la quantificazione dello zucchero sono state eseguite da GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). È stata utilizzata una colonna Restek Rxi-5sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df). La portata era di 1,0 mL min-1 (elio). I rapporti di divisione iniettati erano 1/10 per gli esosi e 1/100 per il saccarosio. Sono state applicate le seguenti condizioni di ingresso: temperatura del forno, 105 ° C per 4 min, quindi a 280 ° C a 15 ° C min-1 (per 20 min) e temperatura dell’iniettore di 250 °C.Il contenuto totale di zucchero di nettare per fiore (mg) è stato quindi calcolato come volume di nettare (µL) x concentrazione totale di zucchero (mg/µL).

Comportamento degli insetti

Nel 2011 e nel 2012 sono state effettuate indagini sulle quattro popolazioni naturali rimanenti nelle fens nel Belgio meridionale. Di questi, la riserva naturale “Les Abattis” (49°40’50″N; 5°32’59″E) contiene la popolazione più grande e densa (2970 m2 con 1330 ± 1030 A. napellus flowers m−2). A “Fouches”(49°4’8″N; 5°43’06” E), che ha la seconda più grande popolazione (1788 m2), individui di A. i napellus erano molto sparsi nell’area e a densità molto più basse (176 ± 177 fiori m−2) “Chantemelle’ (49°39’37″N; 5°39’37″E)” aveva una popolazione discontinua composta da tre macchie (161, 423 e 500 m2) con densità di piante e fiori relativamente basse (179 ± 125 fiori m−2). “Sainte-Marie”(49°40’06″N; 5°32’56” E) aveva una popolazione minuscola e irregolare (292 m2, 152 ± 163 fiori m−2) che si estendeva per circa 150 m lungo un ex binario ferroviario.

I visitatori di fiori sono stati registrati in osservazioni di 10 minuti durante la fioritura di picco in tre giorni consecutivi nel 2011 (tra il 30 agosto e il 3 settembre) e in quattro giorni nel 2012 (tra il 21 e il 27 agosto) con condizioni climatiche asciutte e calde. La percentuale di fiori di fase maschili, durante questi giorni e in tutte le popolazioni, era superiore ai fiori di fase femminili (circa l ‘ 85%). Fiori all’interno di 1 m2 (o circa cinque piante) sono stati osservati allo stesso tempo. Sono state condotte almeno dieci osservazioni per popolazione (massimo 16), distribuite su tutta la popolazione e in diversi momenti della giornata. Per ogni visitatore, abbiamo registrato la specie, il numero di fiori derubati e non calpestati visitati per pianta e patch, il tempo trascorso per singolo fiore e il loro comportamento di foraggiamento (raccolta di polline o nettare, visita legittima o illegittima, denominata rapina (lavoro di base, rapina primaria e secondaria). Durante 530 min di osservazioni floreali nel 2011 e 400 min nel 2012, abbiamo registrato 183 visitatori di fiori. I bombi (B. pascuorum e B. hortorum) e le api mellifere (Apis mellifera) sono stati i principali visitatori di fiori; solo 3 individui di B. terrestris sono stati osservati.

Capacità di carico del polline

Trenta individui per specie sono stati uccisi con acetato di etile e immagazzinati individualmente. Il polline è stato rimosso dalle diverse parti del corpo degli insetti con piccoli cubetti di gelatina-glicerina53. I grani di polline concentrati nella corbicula sono stati rimossi e non inclusi nelle analisi. Tutti i grani di polline sono stati contati con la microscopia ottica.

Purezza della raccolta del polline

Abbiamo campionato i carichi di polline dai bombi che visitano A. napellus nelle popolazioni naturali. In laboratorio, i carichi di polline sono stati acetolizzati 53. Almeno 400 grani di polline scelti a caso di ciascuno dei 25 carichi di polline sono stati identificati e contati al microscopio ottico.

Risposte gustative dei visitatori di insetti

Abbiamo seguito il protocollo di Ma et al.54 per il rilevamento di aconitina. Una volta catturate, le singole api sono state affamate per 3 ore in una fiala di plastica (lunga 7 cm, diametro interno 2,8 cm) a temperatura ambiente e in completa oscurità in laboratorio. Abbiamo trasferito ogni ape in un tubo di tenuta, una provetta da centrifuga da 15 ml con un foro da 4 mm praticato sulla punta e un pezzo di rete d’acciaio fissato all’interno. Dopo una fase di pre-test con una goccia di saccarosio, abbiamo presentato la soluzione di prova in un tubo capillare di vetro da 100 µL e abbiamo spremuto delicatamente il tubo per mantenere la soluzione sulla punta del tubo. Qualsiasi insetto senza estensione della proboscide dopo 5 minuti è stato rimosso dal test. Le fasi del test sono state lunghe 2 minuti e il volume della soluzione prima e dopo il test è stato registrato con una pinza.

I test sono stati eseguiti con tre specie di visitatori (A. mellifera, B. pascuorum e B. terrestris). Dieci individui per specie di insetti sono stati testati con ogni soluzione. Le concentrazioni di saccarosio (430 µg mg−1) e aconitina (232 µg g−1) corrispondevano a quelle presenti nella nostra specie. Sono state presentate tre soluzioni: acqua deionizzata da sola (controllo), soluzione di saccarosio puro e soluzione di saccarosio più aconitina.

Per tutti i test, è stato calcolato un indice di deterrenza per ciascun soggetto dalla scelta di bere, dal volume di soluzione consumata e dal tempo di contatto con la soluzione come segue: ID = 1 – (scelta per saccarosio/scelta per saccarosio + aconitina) × (volume consumato di saccarosio / volume consumato di saccarosio + aconitina) × (tempo di contatto con soluzione di saccarosio/tempo di contatto con soluzione di saccarosio + aconitina).

Analisi statistiche

La normalità dei dati è stata stimata utilizzando i test Shapiro–Wilk e l’omoscedasticità è stata verificata utilizzando i test di Levene. Quando sono stati soddisfatti i requisiti di normalità e omoscedasticità, sono state eseguite analisi della varianza (ANOVA) (effetto di fase floreale sui volatili floreali). In caso contrario, test non parametrici sono stati eseguiti utilizzando il test di Wilcoxon test per il confronto di due condizioni (floreale fase di effetto sulla morfologia del fiore e nettare parametri) e Anterioro-Wallis test per il confronto di più di due condizioni (insetto e soluzione effetto consumato volume e durata di contatto con la soluzione in gustativa esperimenti, insetto effetto sulla visita di comportamento) e chi-square test sono stati eseguiti per confrontare le percentuali di individui in gustativa esperimenti. Le analisi ANOVA e non parametriche sono state seguite da un confronto a più coppie quando sono state confrontate più di due condizioni. Tutte le analisi sono state condotte in SAS Enterprise Guide 7.1. I dati sono presentati come medie ± deviazioni standard.