Realizzazione di HPLC

Introduzione

La cromatografia liquida ad alte prestazioni è fondamentalmente una forma altamente migliorata di cromatografia su colonna. Invece di un solvente che è permesso gocciolare attraverso una colonna sotto gravità, è forzato attraverso sotto le alte pressioni di fino a 400 atmosfere. Questo lo rende molto più veloce.

Consente inoltre di utilizzare una dimensione delle particelle molto più piccola per il materiale di imballaggio della colonna che fornisce un’area di superficie molto maggiore per le interazioni tra la fase stazionaria e le molecole che scorrono oltre di essa. Ciò consente una separazione molto migliore dei componenti della miscela.

L’altro importante miglioramento rispetto cromatografia colonna riguarda i metodi di rilevamento che possono essere utilizzati. Questi metodi sono altamente automatizzati ed estremamente sensibili.

La colonna e il solvente

Confusamente, ci sono due varianti in uso in HPLC a seconda della polarità relativa del solvente e della fase stazionaria.

HPLC in fase normale

Questo è essenzialmente lo stesso che avrai già letto nella cromatografia a strato sottile o nella cromatografia a colonna. Anche se è descritto come “normale”, non è la forma più comunemente usata di HPLC.

La colonna è riempita con minuscole particelle di silice e il solvente è esano non polare, ad esempio. Una colonna tipica ha un diametro interno di 4,6 mm(e può essere inferiore a quello) e una lunghezza da 150 a 250 mm.

I composti polari nella miscela passata attraverso la colonna si attaccheranno più a lungo alla silice polare rispetto ai composti non polari. Quelli non polari passeranno quindi più rapidamente attraverso la colonna.

HPLC a fase inversa

In questo caso, la dimensione della colonna è la stessa, ma la silice viene modificata per renderla non polare attaccando lunghe catene di idrocarburi alla sua superficie-in genere con 8 o 18 atomi di carbonio in esse. Viene utilizzato un solvente polare, ad esempio una miscela di acqua e alcool come il metanolo.

In questo caso, ci sarà una forte attrazione tra il solvente polare e le molecole polari nella miscela che viene fatta passare attraverso la colonna. Non ci sarà tanta attrazione tra le catene di idrocarburi attaccate alla silice (la fase stazionaria) e le molecole polari nella soluzione. Le molecole polari nella miscela passeranno quindi la maggior parte del loro tempo a muoversi con il solvente.

I composti non polari nella miscela tenderanno a formare attrazioni con i gruppi idrocarburici a causa delle forze di dispersione di van der Waals. Saranno anche meno solubili nel solvente a causa della necessità di rompere i legami idrogeno mentre si stringono tra le molecole di acqua o metanolo, per esempio. Pertanto trascorrono meno tempo in soluzione nel solvente e questo li rallenterà nel loro cammino attraverso la colonna.

Ciò significa che ora sono le molecole polari che viaggeranno attraverso la colonna più rapidamente.

HPLC a fase inversa è la forma più comunemente usata di HPLC.