Quadro algoritmico ACsN

ACsN combina calibrazione della telecamera, stima del rumore e filtraggio sparso per correggere le sorgenti di rumore più rilevanti generate da una telecamera sCMOS (Fig. 1a e Note complementari 1 e 2.1). In particolare, ACsN corregge prima il rumore del pattern fisso utilizzando una mappa dell’offset e del guadagno dei pixel sCMOS. La presenza del rumore del modello fisso nelle telecamere sCMOS genera in pixel diversi (p) un numero diverso di fotoelettroni dallo stesso numero di fotoni che interferiscono (Sp). Questo effetto è proporzionale al livello di illuminazione e può essere modellato come un fattore moltiplicativo yp applicato al parametro della variabile Sp distribuita da Poisson. Allo stesso tempo, durante la conversione analogico-digitale (AD), la tensione prodotta da ciascun pixel viene letta come la differenza da un livello di riferimento, che rappresenta l’assenza di luce. In pratica, a questa tensione di riferimento viene assegnato un valore positivo che è responsabile di un bias (ßp) nei valori di intensità misurati. Pertanto, l’acquisizione di un sCMOS fotocamera può essere modellato mediante l’equazione:20

dove Zp è il valore del pixel p, t il tempo di esposizione, e N (0, σR) la Gaussiana distribuito rumore di lettura dei media µR = 0 e deviazione standard σR. Considerando la praticità della microscopia a fluorescenza, in questo modello abbiamo omesso il contributo della corrente oscura, che può essere ignorato per tempi di esposizione inferiori a 1 s, e il rumore di quantizzazione dovuto alla conversione AD, che è trascurabile rispetto al rumore di lettura3,21 (Nota integrativa 2.2).

un concetto dell’algoritmo ACsN. L’immagine in ingresso viene ridimensionata con il guadagno di pixel e le mappe di offset della fotocamera per rimuovere il rumore del pattern fisso (FP). Quindi, utilizzando i parametri sperimentali, il limite OTF viene calcolato e utilizzato per produrre un’immagine filtrata passa-alto, da cui si ottiene la stima del rumore (NE). Infine, il filtro sparse (SF) viene eseguito per generare l’immagine denoised. b Confronto delle variazioni di rumore prima (quadrati grigi) e dopo (cerchi rossi) correzione del rumore. Tutti i dati sono stati divisi per il valore atteso per il rumore puro di Poisson. La linea tratteggiata rappresenta le prestazioni ideali della fotocamera. Per generare questa trama sono stati utilizzati tre diversi set di immagini di microtubuli HeLa. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard temporale (STD) valutata su 100 immagini. c, d Fluttuazione mappe, cioè, STD valutato oltre 100 immagini SCMO acquisite in un tempo di esposizione di 10 ms prima (c) e dopo (d) ACSN denoising. Le intensità sono espresse in unità analogico-digitali (ADU). e, f Immagini ingrandite delle aree contrassegnate dai quadrati bianchi in c e d, rispettivamente. g Fluttuazione temporale dei valori di intensità dei pixel corrispondenti alle aree cerchiate (1 e 2) in e ed f, rispettivamente. I valori delle immagini originali e denoised sono tracciati rispettivamente in grigio e rosso. Barre di scala: 500 nm (a), 1 µm (b), 3 µm (d), 300 nm (f).

Poiché il rumore del modello fisso dipende solo dalla circuiteria della fotocamera, ßp e yp possono essere stimati attraverso una calibrazione una tantum (vedi Metodi). Tuttavia, un’attenta valutazione sia del rumore di lettura distribuito da Gaussian, N(0, σR), sia della fluttuazione dovuta al rumore di fotone distribuito da Poisson, Poi{Sp (τ)}, è necessaria per ottenere una stima accurata del segnale sottostante Sp. Per eseguire questa valutazione, abbiamo ideato un modello di rumore che consente una stima congiunta della varianza del rumore analizzando la risposta in frequenza del sistema di microscopia. Questo si basa sul fatto che la distribuzione di Poisson del rumore del fotone può essere approssimata da una distribuzione gaussiana quando il flusso di fotoni è >3 fotoni per pixel22. In particolare, l’errore introdotto approssimando la varianza di Poisson, \(\sigma _P^2\), con una varianza gaussiana, \(\sigma _G^2\), diventa <1% quando il flusso di fotoni è superiore a 5 fotoni per pixel (Nota supplementare 2.3). In particolare, le condizioni sopra menzionate sul flusso di fotoni sono generalmente soddisfatte per molte applicazioni nella microscopia a fluorescenza23, 24. Pertanto, consideriamo il rumore correlato alla fotocamera come il risultato della somma di due variabili casuali distribuite gaussiane indipendenti, la cui varianza è \(\sigma _N^2 = \sigma _R^2 + \sigma _G^2\). Tale distribuzione consiste in una densità spettrale di potenza costante, mentre i segnali provenienti dal campione sono contenuti all’interno della funzione di trasferimento ottico (OTF)25. Pertanto, sfruttiamo la conoscenza del sistema ottico per valutare la fluttuazione dei pixel al di fuori dell’OTF, che è dovuta solo al rumore, e quindi usiamo il valore ottenuto per derivare σN nell’immagine originale (Nota integrativa 2.3).

Successivamente, l’algoritmo utilizza queste statistiche sul rumore per una valutazione non locale dell’auto-somiglianza del campione e per eseguire filtri sparsi collaborativi sulla sequenza di input. A differenza delle precedenti implementazioni del filtro collaborativo, abbiamo adottato un approccio a strati che sonda sequenzialmente l’auto-somiglianza dell’immagine nello spazio e nel tempo al fine di migliorare la correzione del rumore senza sacrificare la precisione e il runtime. In breve, il filtro scompone l’immagine in patch e le ordina in gruppi tridimensionali (3D) in base alla loro similità26. Quindi, impiega una trasformazione 3D per elaborare ogni gruppo tutto in una volta. Il denoising viene eseguito mediante hard-thresholding e migliorato dal fatto che, a causa della somiglianza tra le patch, la trasformazione 3D risulta in una rappresentazione ancora più sparsa delle patch originali, mentre lo spettro di potenza del rumore rimane costante27. Successivamente, le patch denoised vengono restituite alle loro posizioni originali per formare un’immagine intermedia. A questo punto, il filtro collaborativo viene eseguito una seconda volta, ma sostituendo l’hard-thresholding con un filtro Wiener. Il filtro viene eseguito utilizzando sia le immagini rumorose che quelle intermedie e genera l’immagine denoised finale (Nota complementare 2.4). Va notato che la variazione spaziale del rumore attraverso l’immagine può influenzare le prestazioni del filtro Wiener. Tuttavia, ciò è notevolmente mitigato dall’uso dell’elaborazione basata su patch, che, rispetto all’intera immagine, migliora l’uniformità dell’intensità all’interno dei singoli gruppi di patch, mostrando una grande stabilità contro il rumore spaziale9.

Infine, viene eseguito un altro filtro collaborativo alla ricerca di patch simili anche nei frame vicini. In questo modo, il rumore persistente può essere ulteriormente ridotto sfruttando l’auto-somiglianza del campione nel tempo preservando la risoluzione temporale18 (Nota complementare 2.5).

Caratterizzazione di ACsN

Successivamente, abbiamo caratterizzato le prestazioni di ACsN utilizzando sia dati numerici che sperimentali. In particolare, il filtraggio collaborativo ACsN dipende dalla stima di σN, nonché dalla scelta dei parametri nell’algoritmo28, che sono stati scelti per ottimizzare sia la correzione del rumore che il runtime (Nota integrativa 3.1). Abbiamo osservato che la nostra strategia può attenuare significativamente l’effetto dannoso del rumore della fotocamera, evitando la perdita di risoluzione dell’immagine, specialmente in presenza di rumore altamente spazialmente variante (Nota integrativa 3.2). Inoltre, il rumore della fotocamera può indurre fluttuazioni temporali dei valori dei pixel che non sono correlati al campione, influenzando così l’analisi quantitativa dei dati time-lapse. Il denoising ACsN riduce questo effetto di circa un ordine di grandezza, con fluttuazioni residue paragonabili a quelle di una fotocamera ideale (Fig. 1b-g e Nota complementare 3.3). Inoltre, va notato che a basso numero di fotoni, i dettagli del campione iniziano ad essere comparabili con le fluttuazioni del rumore e diventano più difficili da recuperare. Pertanto, le prestazioni del ripristino dell’immagine sono intrinsecamente correlate al flusso fotonico dell’immagine in ingresso. Tuttavia, utilizzando sia simulazioni che dati sperimentali, abbiamo verificato una robusta correzione del rumore ACsN a livelli di scarsa illuminazione fino a 5-10 fotoni per pixel (Nota supplementare 3.4).

Inoltre, abbiamo convalidato le prestazioni di ACsN sotto varie frequenze di campionamento normalmente adottate per la microscopia a fluorescenza. In pratica, una frequenza di campionamento vicina al criterio di Nyquist rappresenta un buon compromesso tra rapporto segnale-rumore (SNR) e conservazione dei dettagli. Qui, esaminando numericamente e sperimentalmente attraverso una vasta gamma di frequenze di campionamento, abbiamo dimostrato la fattibilità di ACsN per SNR basso con sovracampionamento e nessuna perdita evidente di segnali con sottocampionamento (Nota supplementare 3.5).

A differenza delle immagini naturali, le immagini fluorescenti di campioni biologici sono altamente specificate, esibendo bersagli molecolari o strutture etichettate con precisione nelle cellule. Di conseguenza, ogni immagine fluorescente caratterizza solitamente gli oggetti specifici che ricorrono attraverso il campo di vista, che fornisce l’auto-somiglianza non locale sufficiente per rendere l’algoritmo notevolmente efficiente per la microscopia di fluorescenza. Con dati numerici e sperimentali, abbiamo caratterizzato la dipendenza delle prestazioni ACsN dall’uso dell’auto-somiglianza di un’immagine di input (Nota supplementare 3.6). Inoltre, come mostrato di seguito, abbiamo valutato quantitativamente una varietà di campioni non biologici e biologici per verificare la fattibilità del metodo, che copre varie dimensionalità, morfologia, casualità e densità, come bersagli di calibro, particelle fluorescenti, singole molecole, microtubuli, filamenti di actina, mitocondri, filopodi, lamellipodi e piccoli animali.

Microscopia a ampio campo

La microscopia a ampio campo, in particolare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), è una delle tecniche più utilizzate nell’immagine cellulare29. TIRF utilizza il fenomeno della riflessione interna totale della luce all’interfaccia vetro / acqua per creare un’onda evanescente che si propaga solo per poche centinaia di nanometri attraverso il vetrino coprioggetti. Ciò consente l’eccitazione selettiva delle etichette fluorescenti nella parte inferiore del campione (Fig. 1 bis). Tuttavia, in caso di emettitori fluorescenti deboli, bassa intensità luminosa o breve tempo di esposizione, il rumore correlato a sCMOS diventa grave e peggiora la qualità dell’immagine (Fig. 1 ter). ACSN denoising può ridurre efficacemente tale contributo e recuperare i segnali non distorti dal rumore, consentendo un’acquisizione più rapida senza compromettere il segnale sottostante (Fig. 1 quater, d).

Abbiamo dimostrato ACSN denoising di microscopia a ampio campo in entrambe le configurazioni di epi-fluorescenza e TIRF utilizzando vari campioni sub-cellulari fissi, vivi e multicolori, compresi i microtubuli (Fig. 1 e Fig. 1), mitocondri (Fig. 2 e Film supplementari 1 e 2), e F-actina (Fig. 2). L’uso di ACsN può mantenere la stessa qualità dell’immagine con un tempo di esposizione più breve (cioè, una migliore risoluzione temporale) e un livello di eccitazione più basso (cioè, meno danni alla foto). Le prestazioni sono, quindi, limitate principalmente dalla foto-fisica degli emettitori fluorescenti. Utilizzando metriche quantitative, abbiamo dimostrato che il metodo può recuperare immagini a campo largo con un budget di fotoni di due ordini di grandezza inferiore senza perdita di qualità dell’immagine (Tabella supplementare 1).

a Imaging a epi-fluorescenza dei mitocondri in cellule endoteliali dell’arteria polmonare bovina fissa (BPAE) ad un tempo di esposizione di 1 ms. b La stessa immagine in a dopo ACSN denoising. c – f Immagini ingrandite delle corrispondenti regioni boxed in a e b. Risultati quantitativi e analisi sono riportati nella tabella supplementare 1. g Frame rappresentativo da un time-lapse di 100 immagini di mitocondri in cellule di rene embrionale umano vivo (HEK) registrate a 50 Hz (tempo di esposizione: 20 ms). h Il corrispondente fotogramma rappresentativo della sequenza di immagini (g) ottenuto dopo l’elaborazione ACsN. Gli inserti in g e h mostrano immagini ingrandite delle regioni corrispondenti contrassegnate nella casella bianca tratteggiata in g. i-n Immagini ingrandite delle regioni corrispondenti contrassegnate nella casella gialla continua in g in diversi punti temporali di 200 ms (i, l), 800 ms (j, m) e 1200 ms (k, n). o, p Immagine a doppio colore, rispettivamente, prima di (o) e dopo (p) ACSN denoising di F-actina (ciano) e mitocondri (arancione) in cellule BPAE fisse ottenute mediante microscopia TIRF con un tempo di esposizione di 2 ms. q, r Profili di intensità della sezione trasversale di (o) e (p) lungo la corrispondente linea tratteggiata in o, rispettivamente, mostrando strutture cellulari sostanzialmente denoised e meglio risolti. Barre di scala: 10 µm (b), 3 µm (f), 4 µm (h, p), 1 µm (h, inserto) e (l).

Deconvoluzione e microscopia a campo luminoso

La deconvoluzione dell’immagine è ampiamente utilizzata nella microscopia ottica, dal ripristino di immagini di bassa qualità al miglioramento delle tecniche di super-risoluzione30. Tuttavia, il rumore può facilmente degradare le prestazioni di molti algoritmi comuni producendo artefatti di deconvoluzione. Invece, abbiamo osservato una notevole riduzione di tali artefatti nelle immagini deconvolte impiegando ACSN denoising prima di diversi metodi basati sull’algoritmo di Richardson–Lucy 31, machine learning32 e radial fluctuation33 (Nota supplementare 4.1). Il miglioramento del ripristino dell’immagine si riflette anche in un miglioramento della qualità dell’immagine globale, valutata utilizzando metriche come il coefficiente di Pearson (RSP)34 in scala di risoluzione. Ad esempio, combinando ACsN e fluttuazione radiale, abbiamo generato immagini a super-risoluzione con un valore RSP migliore a una risoluzione temporale fino a due ordini di grandezza superiore a quella attualmente segnalata33 (Fig. 2).

La deconvoluzione dell’immagine è anche alla base della ricostruzione tridimensionale in microscopia a campo luminoso (LFM). LFM impiega un array di microlenti in un sistema di microscopia per ottenere sia le informazioni spaziali bidimensionali (2D) che angolari 2D della luce incidente, consentendo la ricostruzione computazionale dell’intero volume 3D di un campione da un singolo fotogramma della fotocamera35. Tuttavia, il processo di ricostruzione basato sulla deconvoluzione è altamente sensibile al SNR, specialmente a causa dello schema di imaging a ampio campo, volumetrico e veloce di LFM. Per questo motivo, l’uso di ACsN per correggere il rumore nelle immagini raw (Fig. 3a, b) si traduce in un miglioramento chiaramente evidente nelle ricostruzioni 3D del campo luminoso (Fig. 3 quater, d). Infatti, la presenza del rumore porta all’errore di calcolo dell’oggetto 3D o alla propagazione di picchi non associati al fluoroforo. Il primo influisce sul campionamento lungo la dimensione assiale e può comportare una risoluzione assiale irregolare (Fig. 3 sexies, f). Quest’ultimo produce uno sfondo aggiuntivo che copre il segnale di fluorescenza, compromettendo anche la risoluzione laterale (Fig. 3g-i). Utilizzando ACsN, entrambe le carenze possono essere mitigate, con conseguente miglioramento sostanziale del rendering volumetrico 3D delle strutture cellulari.

a, b Immagini grezze di campo luminoso di microtubuli in una cella HeLa prima (a) e dopo (b) l’elaborazione ACsN. Gli inserti mostrano le immagini di microlenti ingrandite delle corrispondenti regioni scatolate, in cui il rumore è stato sostanzialmente ridotto come si vede nelle immagini ricostruite tridimensionali (3D) b. c, d ottenute rispettivamente da a e B. Le informazioni sulla profondità sono codificate in base alla barra della scala dei colori. Gli inserti mostrano le immagini ingrandite delle corrispondenti regioni a scatola bianca tratteggiata, dove si osserva una migliore qualità dell’immagine e una migliore risoluzione 3D dopo il denoising ACsN. e, f Sezioni trasversali sul piano YZ corrispondenti alle linee tratteggiate rosse in c e d, rispettivamente, dove le strutture dei microtubuli sono meglio risolte con artefatti ridotti usando ACsN. g, h Immagini ingrandite delle regioni in scatola solida rossa in c e d, rispettivamente, a z = 1,4 µm, dove le strutture dei microtubuli sono meglio risolte usando ACsN. i Profili trasversali di (g, grigio) e (h, rosso) corrispondenti alle linee tratteggiate bianche in g, h, rispettivamente. I filamenti coperti da rumore di fondo non associato al fluoroforo vengono risolti utilizzando ACsN. Barre di scala: 8 µm (b, d), 800 nm (b, inserto), 3 µm (d, inserto), 1 µm (e, g).

Microscopia di localizzazione a molecola singola

Per convalidare la fattibilità di ACsN per la microscopia di localizzazione a molecola singola (SMLM)36, abbiamo eseguito l’imaging STORM dei mitocondri nelle cellule HeLa (Fig. 3). L’effetto del rumore correlato a sCMOS nella localizzazione di una singola molecola può essere visto in due aspetti: la presenza di falsi negativi, a causa della perdita di molecole debolmente emettenti coperte dal rumore (Fig. 3c, d), e la presenza di falsi positivi, dovuti agli hot pixel o semplicemente alla distribuzione del rumore (Fig. 3 sexies, f). La rimozione del rumore dai dati a singola molecola grezza consente la soppressione di entrambi i tipi di errori di localizzazione, con conseguente miglioramento significativo della qualità dell’immagine STORM e delle metriche come RSP e Resolution Scaled Error (RSE)34 (Fig. 4 bis, lettera b). Inoltre, tale miglioramento dell’efficienza della localizzazione porta ad un migliore contrasto e all’aspetto di caratteristiche non chiaramente visibili nella ricostruzione senza denoising (Fig. 4c-f). Inoltre, la riduzione delle fluttuazioni dei pixel non correlate al campione consente di ottenere una mappa del tasso di lampeggio dei fluorofori che può essere utilizzata per alleviare gli effetti dell’etichettatura imperfetta (Fig. 4).

un’immagine di TEMPESTA di mitocondri in una cella HeLa fissa (RSP: 0.81, RSE: 40.6). immagine della TEMPESTA b ricostruita dopo la denoizzazione ACsN dei dati grezzi di una singola molecola di a (RSP: 0.85, RSE: 36.7). In entrambi i casi, sono stati utilizzati 5000 frame a molecola singola. I fotogrammi rappresentativi dei dati grezzi prima e dopo la denoising sono mostrati in Fig. 3. L’analisi quantitativa dell’immagine con NanoJ-SQUIRREL ha valutato un miglioramento di entrambi i valori RSP ( + 0,04) e RSE (-3,9) in b rispetto ad a. Si osserva che il numero di localizzazioni in b è aumentato rispetto ad a, il che porta ad un migliore contrasto nel primo e alla comparsa di caratteristiche non visibili nel secondo (c–f). g Tracciamento a particella singola di un cordone fluorescente registrato con un tempo di esposizione di 1 ms. Una cornice rappresentativa è mostrata nel riquadro. Ogni colore corrisponde a una delle sei diverse tracce rilevate. h Tracciamento a particella singola dello stesso tallone in g dopo denoising ACsN (inserto). Il SNR migliorato produce una migliore precisione di localizzazione, che si traduce in una singola traiettoria liscia (linea nera). i Frame rappresentativo per il tracciamento di particelle singole biplane a frame rate di 1 kHz (tempo di esposizione: 1 ms) prima (a sinistra) e dopo (a destra) il denoising ACsN. Barre di scala: 4 µm (a), 2 µm (c, e, i), 1 µm (g, inserto), 250 nm (h).

Come l’imaging a singola molecola, la precisione di localizzazione nel tracciamento a particella singola (SPT) è strettamente correlata al numero di fotoni rilevati. Pertanto, un fattore critico che influenza le prestazioni di SPT è l’SNR dei dati dell’immagine37. Abbiamo dimostrato che ACsN può essere utilizzato per ridurre al minimo gli errori di localizzazione responsabili di errata identificazione delle particelle e traiettorie errate (Fig. 4g, h e film supplementare 3). Questo miglioramento SNR si traduce in una migliore precisione di localizzazione delle particelle, cioè una migliore stima dello spostamento laterale del tallone con sensibilità sub-pixel. Questo può essere di grande utilità anche nel biplano SPT, dove la precisione del tracciamento 3D dipende dalla qualità dell’immagine out-of-focus 38 (Fig. 4i, Film supplementare 4, e Nota complementare 4.2).

Microscopia a fluorescenza con fotocamere CMOS a basso costo

Recentemente, i progressi delle fotocamere CMOS industriali di fascia alta hanno suscitato l’interesse della comunità scientifica alla possibilità di avvicinarsi alle prestazioni delle fotocamere sCMOS a un prezzo più acquistabile39,40,41,42. È stato dimostrato che tali telecamere CMOS possono essere utilizzati per SMLM imaging41, 42. Tuttavia, la minore efficienza quantistica e il rumore di lettura più elevato limitano la qualità dell’immagine e l’usabilità generale per la ricerca biomedica quantitativa in molte aree. Affrontare la sfida con un’adeguata strategia di denoising fornirebbe una soluzione critica e tempestiva per trasformare le telecamere di livello industriale per applicazioni di imaging più ampie. Qui, abbiamo implementato per la prima volta ACsN con una telecamera industriale di fascia alta per la microscopia ad ampio campo utilizzando sia l’illuminazione epi che TIRF (Fig. 5 bis-h). In entrambe le configurazioni, ACSN denoising ha notevolmente migliorato la qualità dell’immagine, raggiungendo un accordo prominente con le immagini ottenute dalla fotocamera sCMOS (Fig. 5 e 6, e Tabella supplementare 2).

un’immagine TIRF di F-actina in una cella BPAE fissa, presa a un frame rate di 38 Hz (tempo di esposizione: 26 ms). b La stessa immagine in a dopo ACSN denoising. c Imaging a epi-fluorescenza dei mitocondri in una cellula endoteliale dell’arteria polmonare bovina fissa (BPAE), prelevata a un frame rate di 38 Hz (tempo di esposizione: 26 ms). d La stessa immagine in c dopo ACSN denoising. e-h Ingrandito-in immagini corrispondenti alle regioni boxed in a-d, che mostra il miglioramento della qualità dell’immagine dopo ACSN denoising. In particolare, tale miglioramento è paragonabile alle immagini scattate con i sensori sCMOS, come mostrato nelle figure supplementari. 5 e 6. i, j Immagini di calceina GFP-macchiata in adipociti vivi (lipociti) presi con CMOS a basso costo per microscopia miniaturizzata prima (i) e dopo (j) ACSN denoising. I dati sono stati presi immergendo un miniscopio nella coltura di cellule vive. k-n Immagini ingrandite delle corrispondenti regioni boxed in i e j. o, p Trame dei profili di intensità della sezione trasversale delle strutture cellulari prima (grigio) e dopo (rosso) ACSN denoising lungo le linee tratteggiate in k, l e m, n, rispettivamente. Barre di scala: 10 µm (a, c), 4 µm (e, g), 50 µm (i), 20 µm (k).

Il microscopio miniaturizzato basato su eccitazione a singolo fotone, o miniscopio, è stato sviluppato per eseguire immagini di calcio ad ampio campo in animali che si comportano liberamente43,44,45. La miniaturizzazione richiesta è stata ottenuta sostituendo le lenti obiettivo composto con un gradiente-index (GRIN) lente asta, che offre diversi vantaggi, tra cui basso costo, peso leggero, e relativamente alta apertura numerica. Queste caratteristiche del miniscopio consentono l’imaging minimamente invasivo di un volume significativo del cervello con una risoluzione a livello cellulare durante complessi stati comportamentali, cognitivi ed emotivi46,47,48. Tuttavia, il sensore CMOS a basso costo (MT9V032C12STM, ON Semiconductor, prezzo ~$15) attualmente adottato produce una scarsa qualità dell’immagine al fine di ottenere una velocità di imaging relativamente elevata, che può essere gravemente restrittiva per applicazioni più ampie nell’imaging cellulare. Qui, abbiamo convalidato la fattibilità di ACsN per il sensore miniscope eseguendo imaging a campo largo basato su eccitazione a singolo fotone di calceina macchiata da GFP in adipociti vivi (Fig. 5i-p).

Microscopia a illuminazione piana selettiva

A differenza della microscopia a ampio campo, la microscopia a illuminazione piana selettiva (SPIM) illumina il campione con un foglio di luce perpendicolare alla direzione di osservazione. Ciò evita l’illuminazione inutile, permettendo una rappresentazione a lungo termine ineguagliabile degli esemplari biologici dinamici49,50,51. La microscopia a foglio luminoso a reticolo (LLSM) ottimizza ulteriormente il sistema ottico illuminando il campione con più onde piane che scolpiscono un reticolo ottico invariante52. Tuttavia, mentre sono allo studio nuove strategie per affrontare i problemi relativi ai campioni53, 54, il rumore della fotocamera rimane la limitazione più rilevante per le capacità di imaging SPIM e LLSM a causa del loro segnale di fondo relativamente basso.

Per prima cosa abbiamo dimostrato che il denoising ACsN può superare questa limitazione eseguendo una scansione volumetrica SPIM di un gambero di salamoia fisso. Qui, abbiamo migliorato l’auto-somiglianza utilizzando il filtraggio sparse 3D lungo la direzione di scansione. Dopo l’elaborazione ACsN, abbiamo osservato che la cancellazione del rumore rende i dettagli del campione risaltare meglio in ogni singola fetta (Fig. 7). In particolare, la correzione del rumore del pattern fisso è particolarmente evidente nelle immagini di proiezione ad intensità massima (Fig. 6a, e e film supplementare 5). Inoltre, è notevole osservare un netto miglioramento delle sezioni trasversali ortogonali del volume scansionato (Fig. 6b-d, f-h), consentendo una migliore valutazione delle strutture 3D del campione.

Proiezioni di massima intensità (MIP) di immagini SPIM di un gambero di salamoia adulto etichettato con fluorescenza prima (a) e dopo (e) ACSN denoising. Viste ortogonali lungo il piano XZ delle scansioni volumetriche grezze (b–d) e denoizzate (f–h) a y = 237 mm (b, f), y = 904 mm (c, g) e y = 1491 mm (d, h). Fette lungo il piano XY e YZ sono stati forniti in Fig supplementare. 7. i Rendering tridimensionale di cellule tumorali polmonari umane vive (NCI-H1299 NSCLC) acquisite con LLSM ed elaborate con ACSN denoising. Immagini ingrandite dell’area corrispondente alla casella bianca in i prima (j) e dopo (k) ACSN denoising. La sequenza time-lapse corrispondente è stata fornita nei film supplementari 6 e 7. Le immagini MIP e le fette rappresentative sono raffigurate in fichi supplementari. 9 e 10. Barre di scala: 400 µm (a, e), 100 µm (b, f), 10 µm (i), 4 µm (k).

Per convalidare l’elaborazione ACsN per LLSM, abbiamo prima ripreso le cellule cutanee fisse macchiate di cheratina con EGFP in diversi tempi di esposizione (5, 10 e 20 ms) utilizzando una potenza di illuminazione laser costante di 27 mW (misurata sul piano focale posteriore dell’obiettivo di illuminazione). Queste immagini sono state acquisite utilizzando la modalità di scansione campione e, di conseguenza, le fette dovevano essere deskewed per recuperare le posizioni originali (vedi Metodi). Abbiamo eseguito tale operazione prima di ACSN denoising al fine di utilizzare l’auto-somiglianza lungo z per il filtraggio sparse 3D. Abbiamo osservato che la qualità dell’immagine può essere ben mantenuta denoising anche dopo una riduzione di quattro volte del tempo di esposizione (Fig. 8 e Tabella complementare 3).

Inoltre, abbiamo dimostrato ACSN ripristino delle immagini di time-lapse live-cell LLSM imaging. In primo luogo, abbiamo ripreso le cellule di cancro del polmone umano vivo (NCI-H1299 NSCLC) nella modalità di scansione del campione con intervalli di 18,4 secondi su più di 30 minuti (Fig. 6i-k, Fig. supplementare 9, e film supplementari 6 e 7). Come detto sopra, la modalità di scansione campione richiede la deskewing delle fette volumetriche, che aumenta la dimensione del set di dati e, quindi, la complessità di elaborazione. A differenza del caso precedente, tuttavia, per l’imaging time-lapse siamo stati in grado di utilizzare l’auto-somiglianza temporale, che produce una correzione del rumore più efficiente rispetto a quella volumetrica55. Pertanto, abbiamo denoised le scansioni volumetriche time-lapse elaborando le pile temporali corrispondenti di ogni singola fetta. In questo modo, ACsN potrebbe essere utilizzato prima di deskewing, preservando efficacemente le prestazioni denoising risparmiando il tempo computazionale (Fig. 10). Successivamente, abbiamo osservato il movimento di F-actina endogena in fibroblasti embrionali vivi di topo usando LLSM nella modalità di scansione del foglio (vedi Metodi). In particolare, questa modalità non produce alcun spostamento tra le sezioni e le informazioni volumetriche possono essere recuperate senza deskewing (Fig. 11). In particolare, il movimento dei filopodi intorno alla cellula può essere osservato con maggiore chiarezza dopo la denoising (Film supplementare 8).