spettri di Assorbimento

Lo spettro di assorbimento di tiamina è stato registrato contro l’acqua (Figura 1), è stato trovato che tiamina presenta un massimo di assorbimento di picco (λ max) a 235nm. A causa dell’elevato spostamento del blu λ max della tiamina, la sua determinazione nella forma di dosaggio basata sulla misurazione diretta del suo assorbimento per l’ultravioletto è suscettibile di potenziali interferenze da parte degli eccipienti comuni. Pertanto, la derivatizzazione della tiamina per raggiungere le specie che assorbono la gamma visibile era indubbiamente necessaria. Pertanto, è stata eseguita la derivatizzazione della tiamina con NBD-Cl e lo spettro di assorbimento del prodotto è stato registrato contro il bianco del reagente (Figura 1). Si è constatato che il prodotto è di colore marrone esibendo λmax a 434nm, e il λmax di NBD-Cl era 342nm. Il λmax del derivato tiamina-NBD-Cl è stato spostato in rosso, eliminando qualsiasi potenziale interferenza. La lunghezza d’onda 434 nm è stata quindi fissata come ottimale.

Ottimizzazione delle condizioni di reazione

Figura 1: spettri di Assorbimento di Tiamina (3), NBD-Cl (2) e il complesso tra di loro (1).

Le condizioni ottimali per il metodo sviluppato sono state stabilite variando i parametri uno alla volta mantenendo costanti gli altri parametri e seguendo l’effetto esercitato sull’assorbanza del prodotto colorato. Al fine di stabilire condizioni sperimentali, sono stati studiati l’effetto di vari parametri come pH, tempo, volume tampone e concentrazione di NBD-Cl.

Effetto del pH

L’effetto del pH sulla reazione tra tiamina e NBD-Cl è stato testato variando la forma del pH da 7.0 a 12.0. Come mostrato nella Figura 2, l’assorbanza del prodotto è bassa a pH 7.0, indicando che la tiamina non può reagire con (NBD-Cl) in mezzi neutri. Ciò era probabilmente dovuto all’esistenza del gruppo amminico della tiamina sotto forma di sale cloridrato, che ostacola la capacità di sostituzione nucleofila. Quando il pH è aumentato da 7 a 12, le letture sono aumentate drasticamente, rilasciando il gruppo amminico della tiamina e facilitando la sostituzione nucleofila. L’assorbimento massimo è stato raggiunto al valore pH di 10,5. A valori di pH superiori a 10,5, si è verificata una diminuzione dell’assorbimento. Ciò è stato attribuito probabilmente all’aumento della quantità di hydroxide idrossido che aumenta la velocità della reazione all’indietro della tiamina con NBD-Cl.

Effetto del tempo di reazione

L’assorbanza del prodotto di reazione è stata monitorata in momenti diversi (Figura 3). Mantenendo intatte le altre condizioni, l’assorbanza del prodotto di reazione è stata seguita dopo essere rimasta in piedi per diversi intervalli di tempo a 25°C. I risultati mostrano che la tiamina reagisce con NBD-Cl a 25°C e l’assorbanza inizia ad aumentare gradualmente e raggiunge un massimo dopo 25min. Per tempi di reazione più lunghi, è stata osservata una leggera diminuzione dell’assorbanza. Di conseguenza 25min è stato impostato come tempo di reazione conveniente per la determinazione.

Effetto della quantità del buffer

Figura 2: Effetto del pH sulla reazione della tiamina con NBD-Cl.
Tiamina (20µg / ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0.2% (w/v), tempo di reazione 20 min.

Figura 3: Effetto del tempo di reazione sulla reazione della tiamina con NBD-Cl.
Tiamina (20µg / ml): 1 ml, Tampone (pH 10.5) : 1.5 ml, conc di NBD-Cl. 0,2% (p/v).

Mantenendo il pH a 10,5, è stato studiato anche l’effetto della quantità di soluzione tampone sull’assorbanza del prodotto di reazione (Figura 4). La figura rivela che l’assorbanza del prodotto di reazione aumenta rapidamente con l’aumento della quantità di soluzione tampone e diventa massima quando la quantità di soluzione tampone raggiunge 1,5 ml. Pertanto, la quantità di soluzione tampone da 1,5 ml è stata selezionata per garantire la massima assorbanza.

Effetto della concentrazione di NBD-Cl

Lo studio dell’effetto delle concentrazioni di NBD-Cl ha mostrato che la reazione dipendeva dalla concentrazione del reagente. La più alta intensità di assorbimento è stata raggiunta alla concentrazione di NBD-Cl dello 0,2% (p/v) e una maggiore concentrazione di NBD-Cl porta ad una diminuzione dell’assorbanza (Figura 5).

Dagli esperimenti di regolazione dei parametri di cui sopra, le condizioni ottimizzate utilizzate per il test erano: pH 10,5, concentrazione NBD-Cl 0,2% (w / v), volume del buffer 1,5 mL, tempo di reazione 25min e temperatura 25ºC.

Figura 4: Effetto della quantità di buffer (ml) sulla reazione di tiamina con NBD-Cl.
Tiamina (20µg / ml): 1 ml, Tampone pH: 10,5, NBD-Cl conc. 0.2% (w/v), tempo di reazione 25 min.

Figura 5: Effetto della concentrazione di NBD-Cl sulla sua reazione con la tiamina.
Tiamina (20µg / ml): 1 ml, Tampone (pH 10,5): 1,5 ml, tempo di reazione 25 min.

Convalida del metodo

Il metodo è stato convalidato per i seguenti parametri: specificità, linearità, precisione, accuratezza, limite di rilevazione (LOD), limite di quantificazione (LOQ) e robustezza secondo le linee guida della Conferenza internazionale sull’armonizzazione (ICH).

Linearità, limite di rilevazione (LOD) limite di quantificazione (LOQ)

La linearità è stata valutata mediante analisi di regressione lineare determinato mediante la costruzione di sette concentrazioni di tiamina, nell’intervallo 05–35µg/mL, che è stata calcolata la regressione ai minimi quadrati metodo per calcolare l’equazione di calibrazione e il coefficiente di correlazione. Le curve di calibrazione sono state costruite tracciando la concentrazione rispetto all’assorbanza, utilizzando l’analisi di regressione lineare. L’equazione di regressione per i risultati era A = 0,033 x-0,009 (r2=0,999), dove A è l’assorbanza a 434 nm, x è la concentrazione di tiamina in µg/mL nell’intervallo di 05-35 µg/mL e r è il coefficiente di correlazione (Tabella 1). Si è riscontrato che l’intervallo di concentrazione lineare è paragonabile al nostro metodo precedente utilizzando NQS . Il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati secondo la seguente formula LOD=3.3×SDa / b e LOQ=10×SDa / b, SDa è la deviazione standard dell’intercetta; b è la pendenza sotto le linee guida ICH . Il LOD e il LOQ sono risultati essere rispettivamente 0,667 e 2,020 µg / mL (Tabella 1).

Precisione

L’accuratezza del metodo proposto è stata effettuata applicando 3 diverse concentrazioni 10, 20 e 30 µg/mL di farmaco di tiamina all’interno dell’intervallo lineare calcolato come percentuale del farmaco recuperato dai campioni (Tabella 2).

L’errore relativo (RE) era compreso tra 0,24% e la corrispondente deviazione standard entro 0,004 per tre diverse determinazioni (Tabella 3).

Robustezza

Meccanismo di reazione: È stato riportato che NBD-Cl reagisce con il gruppo amminico di derivati amminici primari o secondari . Allo stesso modo, il gruppo amminico di tiamina può agire come nucleofilo a causa della coppia solitaria di elettroni sull’atomo di azoto, tendendo ad attaccare il centro elettrone–carente in NBD-Cl (Tabella 4 & Figura 6). Allo stesso tempo, è stato dimostrato che la composizione del prodotto è 1:1 di tiamina e NBD-Cl (Figura 7). Quindi si conclude che il gruppo amminico di tiamina reagisce con NBD-Cl per formare un addotto marrone. L’equazione di reazione è mostrata in Figura 7.

Figura 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

Applicazione del metodo proposto all’analisi della forma di dosaggio della tiamina

Le compresse di tiamina sono state sottoposte all’analisi proposta e l’indicazione dell’etichetta concorda bene con il nostro nuovo metodo come mostrato nella Tabella 5. Il metodo proposto ha il vantaggio di essere praticamente privo di interferenze da parte degli eccipienti.

Figure 7: Reazione di tiamina con NBD-Cl mostrando stechiometria 1: 1.