acsn algoritmisk ramme

ACsN kombinerer kamerakalibrering, støjestimering og sparsom filtrering for at korrigere de mest relevante støjkilder genereret af et sCMOS-kamera (Fig. 1a og supplerende bemærkninger 1 og 2.1). Især korrigerer ACsN først støj med fast mønster ved hjælp af et kort over forskydningen og forstærkningen af sCMOS-billedpunkterne. Tilstedeværelsen af støj med fast mønster i sCMOS-kameraer genererer i forskellige billedpunkter (p) et andet antal fotoelektroner fra det samme antal impingerende fotoner (Sp). Denne effekt er proportional med belysningsniveauet og kan modelleres som en multiplikativ faktor yp anvendt på parameteren for den Poisson-distribuerede variabel Sp. Samtidig læses spændingen, der produceres af hvert punkt, under analog-til-digital (AD) konvertering som forskellen fra et referenceniveau, hvilket repræsenterer fraværet af lys. I praksis tildeles denne referencespænding en positiv værdi, der er ansvarlig for en bias (krup) i de målte intensitetsværdier. Derfor kan købet af et sCMOS-kamera modelleres ved ligningen:20

hvor Sp er værdien af billedpunktet p, eksponeringstidens værdi, og N (0, LRR) den gaussisk-distribuerede aflæsningsstøj af gennemsnitlig LRR = 0 og standardafvigelse LRR. I betragtning af det praktiske ved fluorescensmikroskopi har vi i denne model udeladt bidraget fra mørk strøm, som kan ses bort fra eksponeringstider under 1 s, og kvantiseringsstøj på grund af AD-konverteringen,hvilket er ubetydeligt sammenlignet med udlæsningen noise3, 21 (supplerende Note 2.2).

et koncept for acsn-algoritmen. Inputbilledet skaleres med billedforstærkningen og offsetkortene på kameraet for at fjerne støj med fast mønster (FP). Derefter beregnes OHF-grænsen ved hjælp af de eksperimentelle parametre og bruges til at producere et high-pass-filtreret billede, hvorfra støjestimeringen (NE) opnås. Endelig udføres sparsom filtrering (SF) for at generere det denoiserede billede. B sammenligning af støjvariationer før (grå firkanter) og efter (røde cirkler) støjkorrektion. Alle data blev divideret med den forventede værdi for ren Poisson-støj. Den stiplede linje repræsenterer den ideelle kameraydelse. For at generere dette plot blev der brugt tre forskellige sæt billeder af HeLa-mikrotubuli. Fejlbjælkerne repræsenterer den tidsmæssige standardafvigelse (STD) evalueret over 100 billeder. C, d Svingningskort, dvs. STD evaluerede over 100 sCMOS-billeder erhvervet ved en eksponeringstid på 10 ms før (c) og efter (d) ACsN denoising. Intensiteter udtrykkes i analoge til digitale enheder (ADU). e, f-billeder af de områder, der er markeret med de hvide firkanter i henholdsvis c og d. g tidsmæssig udsving i intensitetsværdierne for billedpunkterne svarende til de cirklede områder (1 og 2) i henholdsvis e og f. Værdierne fra de originale og denoiserede billeder er afbildet i henholdsvis grå og rød. Vægtstænger: 500 nm (a), 1 liter (B), 3 liter (d), 300 nm (f).

da støjen med fast mønster kun afhænger af kamerakredsløbet, kan LARP og yp estimeres gennem en engangskalibrering (se metoder). Imidlertid er en omhyggelig vurdering af både den Gaussisk-distribuerede udlæsningsstøj, N(0, larr) og udsving på grund af den Poisson-distribuerede fotonskudstøj, Pois{Sp(Larsen)}, er nødvendig for at opnå et nøjagtigt skøn over det underliggende signal Sp. For at udføre denne vurdering udtænkte vi en støjmodel, der muliggør en fælles estimering af støjvariansen ved at analysere mikroskopisystemets frekvensrespons. Dette er baseret på det faktum, at Poisson-fordelingen af fotonskudsstøjen kan tilnærmes med en Gaussisk fordeling, når fotonstrømmen er >3 fotoner pr.billed22. Især den fejl, der blev indført ved at tilnærme Poisson-variansen, \(\sigma _P^2\), med en Gaussisk varians, \(\sigma _G^2\), bliver <1%, når fotonstrømmen er mere end 5 fotoner pr. Navnlig er de ovennævnte betingelser for fotonstrømmen sædvanligvis opfyldt for mange anvendelser i fluorescensmikroskopi23,24. Derfor betragter vi den kamerarelaterede støj som et resultat af summen af to uafhængige Gaussisk-distribuerede tilfældige variabler, hvis varians er \(\sigma _N^2 = \sigma _R^2 + \sigma _G^2\). En sådan fordeling består af en konstant effektspektral densitet, medens signalerne fra prøven er indeholdt i den optiske overføringsfunktion (OHF)25. Derfor drager vi fordel af viden om det optiske system til at evaluere billedudsving uden for OHF, hvilket kun skyldes støj, og derefter bruger vi den opnåede værdi til at udlede pristn i det originale billede (supplerende Note 2.3).

dernæst bruger algoritmen disse støjstatistikker til en ikke-lokal vurdering af samplens selvlighed og til at udføre kollaborativ sparsom filtrering på inputsekvensen. I modsætning til tidligere implementeringer af samarbejdsfiltrering, vi vedtog en lagdelt tilgang, der sekventielt undersøger billedets selvlighed i rum og tid for at forbedre støjkorrektion uden at ofre nøjagtighed og driftstid. Kort sagt nedbryder filteret billedet i patches og sorterer dem i tredimensionelle (3D) grupper i henhold til deres lighed26. Derefter anvender den en 3D-transformation til at behandle hver gruppe på en gang. Denoising udføres ved hård tærskning og forstærkes af det faktum, at 3D-transformationen på grund af ligheden mellem patcherne resulterer i en endnu mere sparsom repræsentation af de originale patches, mens støjeffektspektret forbliver konstant27. Derefter returneres de denoiserede patches til deres oprindelige placeringer for at danne et mellemliggende billede. På dette tidspunkt køres samarbejdsfilteret en anden gang, men erstatter den hårde tærskelværdi med et Viner-filter. Filteret udføres ved hjælp af både støjende og mellemliggende billeder og genererer det endelige denoiserede billede (supplerende Note 2.4). Det skal bemærkes, at den rumlige variation af støj på tværs af billedet kan påvirke ydeevnen af Viner-filteret. Dette mindskes imidlertid betydeligt ved brug af patchbaseret behandling, som sammenlignet med hele billedet forbedrer intensitetens ensartethed inden for individuelle patchgrupper og udviser en stor stabilitet mod rumligt variant noise9.

endelig udføres et andet samarbejdsfilter på udkig efter lignende patches også i de nærliggende rammer. På denne måde kan langvarig støj reduceres yderligere ved at drage fordel af prøveens selvlighed i tide, samtidig med at den tidsmæssige opløsning18 bevares (supplerende Note 2.5).

karakterisering af ACsN

dernæst karakteriserede vi udførelsen af ACsN ved hjælp af både numeriske og eksperimentelle data. Især afhænger acsn-samarbejdsfiltrering af estimeringen af pristn såvel som af valget af parametrene i algoritmen28, som blev valgt for at optimere både støjkorrektion og driftstid (supplerende Note 3.1). Vi observerede, at vores strategi i væsentlig grad kan dæmpe den skadelige virkning af kamerastøj og undgå tab af billedopløsning, især i nærvær af meget rumligt variantstøj (supplerende Note 3.2). Desuden kan kamerastøj inducere tidsmæssige udsving i billedværdierne, der ikke er relateret til prøven, hvilket påvirker den kvantitative analyse af time-lapse-data. ACsN denoising reducerer denne effekt med ca.en størrelsesorden med resterende udsving, der kan sammenlignes med et ideelt kamera (Fig. 1b-g og supplerende bestemmelse 3.3). Desuden skal det bemærkes, at prøvens detaljer ved lave fotontællinger begynder at være sammenlignelige med støjfluktuationerne og bliver sværere at hente. Således er udførelsen af billedgendannelse iboende relateret til fotonstrømmen af inputbilledet. Ikke desto mindre verificerede vi ved hjælp af både simuleringer og eksperimentelle data en robust acsn-støjkorrektion ved lave lysniveauer ned til 5-10 fotoner pr.

desuden validerede vi udførelsen af ACsN under forskellige prøveudtagningshastigheder, der normalt blev vedtaget til fluorescensmikroskopi. I praksis repræsenterer en prøveudtagningshastighed tæt på kriteriet en god afvejning mellem signal / støjforhold (SNR) og detaljebevarelse. Her undersøgte vi numerisk og eksperimentelt på tværs af en bred vifte af prøveudtagningshastigheder levedygtigheden af ACsN for lav SNR med oversampling og intet mærkbart tab af signaler med underprøveudtagning (supplerende Note 3.5).

I modsætning til naturlige billeder er fluorescerende billeder af biologiske prøver stærkt specificeret og udviser nøjagtigt mærkede molekylære mål eller strukturer i celler. Derfor har hvert fluorescerende billede normalt specifikke objekter, der gentager sig over synsfeltet, hvilket giver tilstrækkelig ikke-lokal selvlighed til at gøre algoritmen særlig effektiv til fluorescensmikroskopi. Med numeriske og eksperimentelle data karakteriserede vi afhængigheden af ACsN-ydeevnen på brugen af selvlighed af et inputbillede (supplerende Note 3.6). Desuden, som vist i det følgende, vi vurderede kvantitativt en række ikke-biologiske og biologiske prøver for at verificere metodens levedygtighed, spænder over forskellige dimensioner, morfologi, tilfældighed og densitet, såsom kalibermål, fluorescerende partikler, enkeltmolekyler, mikrotubuli, actinfilamenter, mitokondrier, filopodia, lamellipodia, og små dyr.

bredfeltmikroskopi

Bredfeltmikroskopi, især total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, er en af de mest anvendte teknikker i cellebilleddannelse29. TIRF bruger fænomenet total intern refleksion af lys ved glas/vandgrænsefladen for at skabe en evanescent bølge, der kun formerer sig for et par hundrede nanometer over dækglasset. Dette muliggør selektiv ophidselse af de fluorescerende etiketter i bunden af prøven (supplerende Fig. 1a). I tilfælde af svage fluorescerende emittere, lav lysintensitet eller en kort eksponeringstid bliver sCMOS-relateret støj imidlertid alvorlig og forringer billedkvaliteten (supplerende Fig. 1b). ACsN denoising kan effektivt reducere et sådant bidrag og genvinde de uforvrængede signaler fra støj, hvilket muliggør hurtigere erhvervelse uden at gå på kompromis med det underliggende signal (supplerende Fig. 1c, d).

Vi demonstrerede ACsN-denoisering af bredfeltmikroskopi i både epi-fluorescens-og TIRF-konfigurationer ved hjælp af forskellige faste, levende og flerfarvede subcellulære prøver, inklusive mikrotubuli (Fig. 1 og supplerende Fig. 1), mitokondrier (Fig. 2 og supplerende film 1 og 2), og F-actin (Fig. 2). Brug af ACsN kan opretholde den samme billedkvalitet med en kortere eksponeringstid (dvs.bedre tidsmæssig opløsning) og et lavere eksitationsniveau (dvs. mindre fotoskader). Ydeevnen er således primært begrænset af foto-fysik af de fluorescerende emittere. Ved hjælp af kvantitative målinger viste vi, at metoden kan gendanne vidvinkelbilleder med et fotonbudget to størrelsesordener lavere uden tab af billedkvalitet (supplerende tabel 1).

a Epi-fluorescensafbildning af mitokondrier i endotelceller med fast bovin lungearterie (BPAE) ved en eksponeringstid på 1 ms. b det samme billede i A efter ACsN-denoisering. C-F-billeder af de tilsvarende boksede regioner i A og b. kvantitative resultater og analyser er rapporteret i supplerende tabel 1. g repræsentativ ramme fra en tidsforløb på 100 billeder af mitokondrier i levende humane embryonale nyreceller (HEK) registreret ved 50 timer (eksponeringstid: 20 ms). h den tilsvarende repræsentative ramme for billedsekvensen (g) opnået efter ACsN-behandling. Indsatserne i g og h viser billeder af de tilsvarende regioner markeret i den stiplede hvide boks i g. i–n-i billeder af de tilsvarende regioner markeret i den faste gule boks i g på forskellige tidspunkter på 200 ms (i, l), 800 ms (j, m) og 1200 ms (k, n). O, p Dobbeltfarvebillede henholdsvis før (o) og efter (p) ACsN-denoisering af F-actin (cyan) og mitokondrier (orange) i faste bpae-celler opnået ved TIRF-mikroskopi med en eksponeringstid på 2 ms. Tværsnitsintensitetsprofiler af (o) og (p) langs den tilsvarende stiplede linje i henholdsvis o, der viser i det væsentlige denoiserede og bedre opløste cellulære strukturer. Vægtstænger: 10 liter (b), 3 liter (f), 4 liter (h, p), 1 liter (h, indsats) og (l).

Deconvolution og lysfeltmikroskopi

Billeddeconvolution anvendes i vid udstrækning i optisk mikroskopi, fra restaurering af billeder af lav kvalitet til forbedring af superopløsningsteknikker30. Støj kan dog let forringe ydeevnen for mange almindelige algoritmer ved at producere deconvolution artefakter. I stedet observerede vi en bemærkelsesværdig reduktion af sådanne artefakter i dekonvolverede billeder ved at anvende ACsN denoising forud for forskellige metoder baseret på Richardson–Lucy algorithm31, machine learning32 og radial fluktuation33 (supplerende Note 4.1). Forbedringen af billedgendannelse afspejles også af en forbedring af den globale billedkvalitet, evalueret ved hjælp af målinger som f.eks Resolution Scaled Pearson ‘ s coefficient (RSP)34. For eksempel ved at kombinere ACsN og radial udsving genererede vi superopløsningsbilleder med en bedre RSP-værdi ved en tidsmæssig opløsning op til to størrelsesordener højere end i øjeblikket rapporteret33 (supplerende Fig. 2).

Billeddekonvolution er også grundlaget for tredimensionel rekonstruktion i lysfeltmikroskopi (LFM). LFM anvender et microlens-array i et mikroskopisystem for at opnå både den todimensionale (2D) rumlige og 2D vinkelinformation om det indfaldende lys, hvilket muliggør beregningsrekonstruktion af det fulde 3D-volumen af en prøve fra en enkelt kameraramme35. Imidlertid er den deconvolution-baserede genopbygningsproces meget følsom over for SNR, især på grund af LFMS bredfelt, volumetriske og hurtige billeddannelsesskema. Af denne grund er brugen af ACsN til at korrigere støj i de rå billeder (Fig. 3A, b) resulterer i klart mærkbar forbedring i 3D-lysfeltrekonstruktionerne (Fig. 3c, d). Faktisk fører tilstedeværelsen af støj til fejlberegning af 3D-objektet eller udbredelsen af ikke-fluorophore-associerede toppe. Førstnævnte påvirker prøveudtagningen langs den aksiale dimension og kan resultere i en ujævn aksial opløsning (Fig. 3e, f). Sidstnævnte frembringer yderligere baggrund, der dækker fluorescenssignalet, hvilket også forringer den laterale opløsning (Fig. 3g-i). Ved hjælp af ACsN kan begge mangler afhjælpes, hvilket resulterer i væsentligt forbedret 3D-volumetrisk gengivelse af cellulære strukturer.

a, B rå lysfeltbilleder af mikrotubuli i en HeLa-celle før (A) og efter (b) ACsN-behandling. Indsatserne viser mikrolinsebillederne i de tilsvarende boksede områder, hvor støj er blevet væsentligt reduceret som set i b. c, d tredimensionelle (3D) rekonstruerede billeder opnået fra henholdsvis A og b. Dybdeinformationen er kodet i henhold til farveskalabjælken. Indsatserne viser billederne af de tilsvarende hvide stiplede boksede områder, hvor bedre billedkvalitet og forbedret 3D-opløsning observeres efter ACsN denoising. de røde stiplede linjer i henholdsvis c og d, hvor mikrotubulistrukturer bedre løses med reducerede artefakter ved hjælp af ACsN. G, h-i billeder af de røde faste boksede regioner i henholdsvis c og d ved h = 1,4 liter, hvor mikrotubulistrukturer bedre løses ved hjælp af ACsN. i Tværsnitsprofiler af (g, grå) og (h, rød) svarende til de hvide stiplede linjer i henholdsvis g, h. Filamenter dækket af ikke-fluorophore-associeret baggrundsstøj løses ved hjælp af ACsN. Vægtstænger: 8 liter (b, d), 800 nm (b, indsats), 3 liter (d, indsats), 1 liter (e, g).

enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi

for at validere muligheden for ACsN til enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM)36 udførte vi STORMAFBILDNING af mitokondrier i HeLa-celler (supplerende Fig. 3). Effekten af sCMOS-relateret støj i enkeltmolekylelokalisering kan ses i to aspekter: tilstedeværelsen af falske negativer på grund af tabet af svagt emitterende molekyler dækket af støj (supplerende Fig. 3c, d) og tilstedeværelsen af falske positiver på grund af de varme billedpunkter eller simpelthen støjfordelingen (supplerende Fig. 3e, f). Fjernelse af støj fra de rå enkeltmolekyledata muliggør undertrykkelse af begge typer lokaliseringsfejl, hvilket resulterer i signifikant forbedret STORMBILLEDKVALITET og målinger såsom RSP og Resolution Scaled Error (RSE)34 (Fig. 4a, b). En sådan forbedret effektivitet af lokalisering fører også til en bedre kontrast og udseendet af funktioner, der ikke er tydeligt synlige i genopbygningen uden denoising (Fig. 4c-f). Desuden tillader reduktionen af punktudsving, der ikke er relateret til prøven, at opnå et kort over fluorophorernes blinkhastighed, der kan bruges til at lindre virkningerne af ufuldkommen mærkning (supplerende Fig. 4).

et STORMBILLEDE af mitokondrier i en fast HeLa-celle (RSP: 0.81, RSE: 40.6). B STORMBILLEDE rekonstrueret efter ACsN-denoisering af rå enkeltmolekyledata af a (RSP: 0.85, RSE: 36.7). I begge tilfælde blev der anvendt 5000 enkeltmolekylrammer. Repræsentative rammer for rådataene før og efter denoising er vist i supplerende Fig. 3. Kvantitativ billedanalyse med NanoJ-egern vurderede en forbedring af både RSP (+0,04) og RSE (-3,9) værdier i b sammenlignet med a. Det observeres, at antallet af lokaliseringer i b øges i sammenligning med a, hvilket fører til en bedre kontrast i førstnævnte og til udseendet af funktioner, der ikke er synlige i sidstnævnte (c–F). g enkeltpartikelsporing af en fluorescerende perle registreret med en eksponeringstid på 1 ms. En repræsentativ ramme vises i indsatsen. Hver farve svarer til en af de seks forskellige spor opdaget. h enkeltpartikelsporing af den samme perle i g efter ACsN denoising (indsat). Den forbedrede SNR giver en bedre lokaliseringsnøjagtighed, hvilket resulterer i en enkelt, glat bane (sort linje). i repræsentativ ramme til biplan-enkeltpartikelsporing ved 1 mm billedhastighed (eksponeringstid: 1 ms) før (venstre) og efter (højre) ACsN-denoisering. Vægtstænger: 4 liter (a), 2 liter (c, e, i), 1 liter (g, indsats), 250 nm (h).

ligesom enkeltmolekylebilleddannelse er lokaliseringspræcisionen i enkeltpartikelsporing (SPT) tæt forbundet med antallet af detekterede fotoner. Derfor er en kritisk faktor, der påvirker SPT ‘ s ydeevne, SNR for billeddata37. Vi viste, at ACsN kan bruges til at minimere lokaliseringsfejl, der er ansvarlige for forkert identifikation af partikler og fejlagtige baner (Fig. 4G, h og supplerende film 3). Denne SNR-forbedring resulterer i en bedre partikellokaliseringsnøjagtighed, dvs.en bedre estimering af perlens laterale forskydning med underpunktsfølsomhed. Dette kan være til stor nytte også i biplane SPT, hvor nøjagtigheden af 3D-sporing afhænger af kvaliteten af out-of-focus image38 (Fig. 4i, supplerende Film 4 og supplerende Note 4.2).

fluorescensmikroskopi med billige CMOS-kameraer

for nylig har fremskridtene med avancerede CMOS-kameraer i industriel kvalitet udløst det videnskabelige samfunds interesse for muligheden for at nærme sig ydelsen af sCMOS-kameraer til en mere overkommelig pris39, 40,41,42. Det har vist sig,at sådanne CMOS-kameraer kan anvendes til SMLM imaging41, 42. Den lavere kvanteeffektivitet og den højere udlæsningsstøj begrænser imidlertid billedkvaliteten og den generelle anvendelighed til kvantitativ biomedicinsk forskning på mange områder. At tackle udfordringen med en ordentlig denoiseringsstrategi ville give en kritisk og rettidig løsning til at transformere kameraer i industriel kvalitet til bredere billeddannelsesapplikationer. Her implementerede vi først ACsN med et avanceret industrielt kamera til bredfeltmikroskopi ved hjælp af både epi-og TIRF-belysning (Fig. 5a-h). I begge konfigurationer forbedrede ACsN denoising væsentligt billedkvaliteten og opnåede fremtrædende overensstemmelse med de billeder, der blev opnået af sCMOS-kameraet (supplerende Fig. 5 og 6 og supplerende tabel 2).

et TIRF-billede af F-actin i en fast bpae-celle, taget med en billedhastighed på 38 timer (eksponeringstid: 26 ms). b det samme billede i en efter ACsN denoising. C Epi-fluorescensafbildning af mitokondrier i en fast bovin lungearterieendotelcelle (BPAE), taget med en billedhastighed på 38 timer (eksponeringstid: 26 ms). d det samme billede i c efter ACsN denoising. e-h-Billeder svarende til de boksede regioner i a–D, der viser forbedring af billedkvaliteten efter ACsN-denoising. Især er en sådan forbedring sammenlignelig med de billeder, der er taget med sCMOS-sensorer, som vist i supplerende Fig. 5 og 6. I, j billeder af GFP-farvet calcein i levende adipocytter (lipocytter) taget med billige CMOS til miniaturiseret mikroskopi før (i) og efter (j) ACsN denoising. Dataene blev taget ved at nedsænke et miniscope i levende cellekultur. k-n-billeder af de tilsvarende boksede regioner i i og j. O, P Plots af tværsnitsintensitetsprofilerne af cellulære strukturer før (grå) og efter (rød) ACsN denoising langs de stiplede linjer i henholdsvis K, l og m, n. Vægtstænger: 10 liter (a, c), 4 liter (e, g), 50 liter (i), 20 liter (k).

det enkeltfoton-eksitationsbaserede miniaturiserede mikroskop eller miniscope er udviklet til at udføre bredfeltkalciumafbildning i frit opførte dyr43, 44, 45. Den krævede miniaturisering blev opnået ved at erstatte sammensatte objektivlinser med en gradientindeks (GRIN) stanglinse, som giver flere fordele, herunder lave omkostninger, let vægt og relativt høj numerisk blænde. Disse funktioner i miniscope muliggør minimalt invasiv billeddannelse af et signifikant volumen af hjernen med en cellulær opløsning under komplekse adfærdsmæssige, kognitive og følelsesmæssige tilstande46,47,48. Imidlertid giver den billige CMOS-sensor (MT9V032C12STM, på halvleder, Pris ~$15), der i øjeblikket er vedtaget, en dårlig billedkvalitet for at opnå en relativt høj billedhastighed, hvilket kan være alvorligt restriktivt for bredere applikationer i celleafbildning. Her validerede vi muligheden for ACsN til miniscope-sensoren ved at udføre enkeltfoton-eksitationsbaseret, bredfeltbilleddannelse af GFP-farvet calcein i levende adipocytter (Fig. 5i-p).

selektiv planbelysningsmikroskopi

i modsætning til bredfeltmikroskopi lyser selektiv planbelysningsmikroskopi (SPIM) prøven med et lysark vinkelret på observationsretningen. Dette undgår unødvendig belysning, hvilket muliggør en uovertruffen langsigtet billeddannelse af dynamiske biologiske prøver49,50,51. Lattice light-sheet microscopy (LLSM) optimerer yderligere det optiske system ved at belyse prøven med flere planbølger, der skulpturerer en formerings-invariant optisk gitter52. Imidlertid, mens nye strategier undersøges for at håndtere stikprøverelaterede problemer53,54, kamerastøj er fortsat den mest relevante begrænsning for SPIM-og LLSM-billeddannelsesfunktioner på grund af deres relativt lave baggrundssignal.

Vi demonstrerede først, at ACsN denoising kan overvinde denne begrænsning ved at udføre en SPIM volumetrisk scanning af en fast saltlage rejer. Her forbedrede vi selvligheden ved hjælp af 3D sparsom filtrering langs scanningsretningen. Efter ACsN-behandling observerede vi, at støjdæmpning får prøvens detaljer til at skille sig bedre ud i hver enkelt skive (supplerende Fig. 7). Især er korrektionen af støj med fast mønster især mærkbar i de maksimale intensitetsprojektionsbilleder (Fig. 6a, e og supplerende film 5). Derudover er det bemærkelsesværdigt at observere en klar forbedring i det ortogonale tværsnit af det scannede volumen (Fig. 6b-D, f-h), hvilket giver mulighed for en bedre vurdering af prøveens 3D-strukturer.

maksimal intensitetsprojektioner (MIP) af SPIM-billeder af en fluorescerende mærket voksen saltvandrejer før (A) og efter (e) ACsN denoising. Orthogonale visninger langs planet af de rå (b–d) og denoiserede (f–h) volumetriske scanninger ved y = 237 mm (b, f), y = 904 mm (c, g) og y = 1491 mm (d, h). I tillæg Fig. 7. i tredimensionel gengivelse af levende humane lungecancerceller (nci-H1299 NSCLC) erhvervet med LLSM og behandlet med ACsN denoising. Billeder af det område, der svarer til den hvide boks i i før (j) og efter (k) ACsN denoising. Den tilsvarende time-lapse-sekvens er tilvejebragt i supplerende Film 6 og 7. MIP-billeder og repræsentative skiver er afbildet i supplerende figner. 9 og 10. Vægtstænger: 400 liter (A, e), 100 liter (b, f), 10 liter (i), 4 liter (k).

for at validere ACsN-behandling for LLSM afbildede vi først faste hudceller farvet for Keratin med EGFP ved forskellige eksponeringstider (5, 10 og 20 ms) ved hjælp af en konstant laserbelysningskraft på 27 mv (målt ved belysningsmålets bagside). Disse billeder blev erhvervet ved hjælp af prøvescanningstilstand, og derfor måtte skiverne skrues sammen for at hente de oprindelige positioner (se metoder). Vi udførte en sådan operation før ACsN denoising for at udnytte selvligheden langs Å til 3D sparsom filtrering. Vi observerede, at billedkvaliteten kan opretholdes godt ved denoising selv efter en firdobling af eksponeringstiden (supplerende Fig. 8 og supplerende tabel 3).

desuden demonstrerede vi acsn-billedgendannelse af time-lapse live-celle LLSM-billeddannelse. Først afbildede vi levende humane lungecancerceller (NCI-H1299 NSCLC) i prøvescanningstilstand med intervaller på 18,4 s over mere end 30 min (Fig. 6i-k, supplerende Fig. 9 og supplerende Film 6 og 7). Som nævnt ovenfor kræver prøvescanningstilstanden skrivebordsyning af de volumetriske skiver, hvilket øger datasætets størrelse og derefter behandlingskompleksiteten. I modsætning til det foregående tilfælde var vi imidlertid i stand til at udnytte den tidsmæssige selvlighed til time-lapse-billeddannelse, hvilket giver en mere effektiv støjkorrektion sammenlignet med den volumetriske one55. Derfor, vi denoised time-lapse volumetriske scanninger ved at behandle de tilsvarende tidsmæssige stakke af hver enkelt skive. På denne måde kunne ACsN bruges før skrivebordsopbygning, hvilket effektivt bevarer denoiseringsydelsen, samtidig med at beregningstiden spares (supplerende Fig. 10). Dernæst observerede vi bevægelsen af endogent F-actin i levende musembryonale fibroblaster ved hjælp af LLSM i arkscanningstilstand (se metoder). Især producerer denne tilstand ikke noget skift mellem skiverne, og den volumetriske information kan hentes uden deskying (supplerende Fig. 11). Især kan bevægelsen af filopodia rundt om cellen observeres med højere klarhed efter denoisering (supplerende Film 8).