udførelse af HPLC

introduktion

højtydende væskekromatografi er dybest set en meget forbedret form for søjlekromatografi. I stedet for at et opløsningsmiddel får lov til at dryppe gennem en søjle under tyngdekraften, tvinges det igennem under høje tryk på op til 400 atmosfærer. Det gør det meget hurtigere.

det giver dig også mulighed for at bruge en meget mindre partikelstørrelse til søjlepakningsmaterialet, hvilket giver et meget større overfladeareal til interaktioner mellem den stationære fase og molekylerne, der strømmer forbi den. Dette muliggør en meget bedre adskillelse af blandingens komponenter.

den anden væsentlige forbedring i forhold til kolonnekromatografi vedrører de detektionsmetoder, der kan anvendes. Disse metoder er meget automatiserede og ekstremt følsomme.

kolonnen og opløsningsmidlet

forvirrende er der to varianter i brug i HPLC afhængigt af opløsningsmidlets relative polaritet og den stationære fase.

Normal fase HPLC

Dette er stort set det samme, som du allerede har læst om i tyndtlagskromatografi eller kolonnekromatografi. Selvom det beskrives som “normalt”, er det ikke den mest almindeligt anvendte form for HPLC.

søjlen er fyldt med små silicapartikler, og opløsningsmidlet er f.eks. En typisk søjle har en indvendig diameter på 4,6 mm (og kan være mindre end den) og en længde på 150 til 250 mm.

polære forbindelser i blandingen, der føres gennem søjlen, klæber længere til det polære silica end ikke-polære forbindelser vil. De ikke-polære vil derfor passere hurtigere gennem søjlen.

omvendt fase HPLC

i dette tilfælde er søjlestørrelsen den samme, men silicaen modificeres for at gøre den ikke-polær ved at fastgøre lange carbonhydridkæder til dens overflade – typisk med enten 8 eller 18 carbonatomer i dem. Et polært opløsningsmiddel anvendes-for eksempel en blanding af vand og en alkohol som methanol.

i dette tilfælde vil der være en stærk tiltrækning mellem det polære opløsningsmiddel og polære molekyler i blandingen, der føres gennem søjlen. Der vil ikke være så meget tiltrækning mellem carbonhydridkæderne fastgjort til silica (den stationære fase) og de polære molekyler i opløsningen. Polære molekyler i blandingen vil derfor bruge det meste af deres tid på at bevæge sig med opløsningsmidlet.

ikke-polære forbindelser i blandingen vil have tendens til at danne attraktioner med carbonhydridgrupperne på grund af dispersionskræfter. De vil også være mindre opløselige i opløsningsmidlet på grund af behovet for at bryde hydrogenbindinger, når de klemmer ind mellem vand-eller methanolmolekylerne. De bruger derfor mindre tid i opløsning i opløsningsmidlet, og dette vil bremse dem på vej gennem søjlen.

det betyder, at det nu er de polære molekyler, der vil rejse gennem søjlen hurtigere.

omvendt fase HPLC er den mest almindeligt anvendte form for HPLC.