GDF11PRO-Fc binder til både GDF11 og MSTN

for at vise, at GDF11PRO-Fc kan sekvestrere aktiv moden GDF11 dimer via en direkte interaktion havde vi til formål at identificere en protein-protein-interaktion mellem gdf11 og gdf11pro-FC. På grund af den tætte strukturelle homologi af GDF11 og MSTN modne dimerer ønskede vi også at afgøre, om GDF11PRO-Fc associerer med MSTN. For at identificere disse protein-protein-interaktioner udførte vi et sæt nedtrækningsanalyser (Fig. 1). Liganderne rGDF11, rMSTN og rActivin A blev inkuberet med lysatfraktioner fra HEK293 celler transficeret med et plasmid, der koder for GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc ved pH 7,4. På grund af de konjugerede Fc-fragmenter på de modificerede propeptider kunne fraktioner trækkes direkte ned på et protein A/G agaroseharpiks. Som forventet trak GDF11PRO-Fc effektivt både rgdf11 og rMSTN ned, hvilket indikerer, at GDF11PRO-Fc var i stand til at binde begge ligander. Derudover trak MPRO-Fc med succes både rGDF11 og rMSTN ned. Både GDF11PRO-Fc og MPRO-Fc var ikke i stand til at trække ned den mere fjernt beslægtede TGF-karrus superfamilie ligand rActivin A, hvilket indikerer, at ligandbinding er specifik (Fig. 1). Der blev ikke observeret nogen binding af GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN eller rActivin A på en kontrolagaroseharpiks uden protein A/G. Ud fra disse resultater konkluderer vi, at GDF11PRO-Fc spontant associerer med de modne GDF11-og MSTN-dimerer ved fysiologisk pH.

GDF11PRO-Fc associerer med GDF11 og MSTN. Protein-protein-interaktioner mellem GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc og rGDF11, rMSTN eller rActivin A blev bestemt ved en nedtrækningsanalyse. GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc blev inkuberet med rGDF11, rMSTN, eller rActivin A i 1 time ved 4 liter C. Fc-smeltede proteinkomplekser blev adskilt på et protein A/G-belagt agaroseharpiks, og eluater blev kørt på en 12% SDS-side gel under reducerende betingelser og undersøgt af vestlig blot. Input kontrol var 5% af input materiale.

GDF11PRO-Fc blokerer GDF11 / MSTN-induceret atrofi i c2c12 myotubes

tilsætning af rGDF11 og rMSTN til differentierede myotubes har tidligere vist sig at inducere atrofi i Murin C2C12 og primær human skelet MYOTUBES. Efter at have fastslået, at GDF11PRO-Fc binder GDF11 og MSTN, spurgte vi næste, om GDF11PRO-Fc kunne forhindre GDF11/MSTN-induceret myotube atrofi i differentierede c2c12 myotubes. For at opnå dette pakket vi DNA-sekvensen kodning for GDF11PRO-Fc i aav6 capsid for at generere aav6-GDF11PRO-Fc vektoren. I disse eksperimenter blev aav6-vektoren valgt for sin evne til effektivt og selektivt at transducere differentierede c2c12 myotubes, men ikke myoblaster . C2c12-myoblaster blev dyrket og differentieret i 5 dage før behandling med aav6-GDF11PRO-Fc eller aav6-EGFP (kontrolvektor) ved en MOI på 105 (Fig. 2a). Som forventet var GFP-ekspression observerbar i c2c12 myotubes inficeret med aav6-EGFP ved 48-72 timer efter infektion, og kvantificering af internaliserede vektorgenomkopier pr.diploid genom ved 72 timer efter infektion indikerede, at vektortransduktion var tilstrækkeligt opnået (Fig. 2b og c).

GDF11PRO-Fc blokerer GDF11/MSTN-induceret myotube atrofi i c2c12 celler. en skematisk detaljering eksperimentel tidslinje i c2c12 myotubes. AAV6-EGFP eller AAV6-GDF11PRO-Fc blev føjet til c2c12 myotubes ved en MOI på 105 på dag 5 efter differentiering, og 100 ng/ml rGDF11 eller rMSTN blev tilføjet på dag 7. Myotubes blev farvet og analyseret på dag 10. B EGFP-ekspression var tydelig ved 48-72 timer i c2c12 myotubes behandlet med AAV6-EGFP (MOI 10 ). Skalestænger repræsenterer 50 liter. C vektor genom kopi nummer pr diploid genom i c2c12 myotubes 72 h efter tilsætning af aav6-EGFP eller aav6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). D repræsentative immunofluorescensbilleder af c2c12 myotubes. C2c12 myotube membraner blev visualiseret ved farvning med et anti-dystrophin antistof (rødt). Kerner blev farvet med DAPI (blå). Inset viser et område, der er beboet. Vægtstænger repræsenterer 50 liter (hovedpanel) og 25 liter (panelindsats). e fraktionen af kerner inkorporeret i myotubes (differentieringsindeks) blev beregnet og præsenteret som en procentdel af kontrol. f gennemsnitlig myotube diameter i forhold til kontrol og (g) fordeling af diametermålinger. For myotube diameter målinger, hver myotube blev målt på tre punkter langs længden af myotube og gennemsnit. h antal kerner inkorporeret pr myotube. Mindst 50 myotubes blev analyseret pr. jeg pSMAD2/3 i forhold til tSMAD2 / 3 blev vurderet af vestlige blot. Lige proteinbelastning blev verificeret ved Ponceau s-farvning, og GAPDH blev anvendt som belastningskontrol. Data repræsenterer resultater fra tre separate eksperimenter. Alle fejlbjælker repræsenterer middelkurs sem. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Tooghalvfjerds timer senere blev myotubes fikseret og farvet til immunofluorescensanalyse ved anvendelse af et antistof, der genkender dystrophin (stang 22/stang 23) for at visualisere myotube perifere membraner og DAPI for at plette myonuklei (Fig. 2d). En reduktion i differentieringsindekset, som er defineret som andelen af myonuklei inkorporeret i myotubes, blev observeret i myotubes behandlet med rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) eller rMSTN (− 14%, p = 0,0013) i forhold til ubehandlet kontrol. Denne effekt blev imidlertid stumpet i GDF11PRO-Fc-udtryk C2C12 myotubes behandlet med rGDF11 (− 1,9%; p = 0.0047 sammenlignet med rgdf11-behandlet kontrol) eller rMSTN (− 3,0%; p = 0,0040 sammenlignet med rMSTN-behandlet kontrol; Fig. 2e). Derudover modstod c2c12 myotubes, der blev behandlet med aav6-GDF11PRO-Fc rgdf11 eller rMSTN-induceret myotube-atrofi. Et væsentligt fald i den gennemsnitlige myotubediameter i forhold til kontrol blev påvist i myotubes behandlet med rGDF11 (− 39%; 0,0002) eller rMSTN (− 35%; p = 0,0003) sammenlignet med kontrol. Tværtimod myotubes, der udtrykker GDF11PRO-Fc behandlet med rGDF11 (- 1,8%; p = 0,0005 sammenlignet med rgdf11− behandlet kontrol) eller rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075 sammenlignet med rmstn-behandlet kontrol) var stort set upåvirket (Fig. 2f og g). I et separat eksperiment var GDF11PRO-Fc ikke i stand til at forhindre rActivin a-induceret myotube-atrofi, hvilket er i tråd med observationen om, at GDF11PRO-Fc ikke binder activin a (yderligere fil 1: Figur S3).

behandling med rGDF11 eller rMSTN var også forbundet med en lavere andel af modne myotuber med højere antal myonukleier, hvilket antyder en inhibering af myotube-differentiering. Myotubes med mere end 11 myonukleier udgjorde kun 5,2% (p = 0,0215) og 7,2% (p = 0.0328) af myotubes analyseret i celler behandlet med henholdsvis rGDF11 og rMSTN. Til sammenligning udgjorde myotubes med mere end 11 kerner 26% af myotubes analyseret i kontrol myotubes. I myotubes, der udtrykte GDF11PRO-Fc, der blev behandlet med rGDF11 eller rMSTN, var andelen af myotubes med mere end 11 myonuklei henholdsvis 22% (p = 0,0104 sammenlignet med rgdf11-behandlet kontrol) og 19% (p = 0,0404 sammenlignet med rMSTN-behandlet kontrol) (Fig. 2h). Endelig, i overensstemmelse med hvad der kunne forventes efter GDF11/MSTN-signalering ved ActRII, var en stigning i phosphoryleret SMAD2/3 (pSMAD2/3) proteinniveauer i myotubes behandlet med AAV6-EGFP og rGDF11 eller rMSTN observerbar på vestlig blot 24 timer efter tilsætning af ligand (Fig. 2i). Denne stigning i psmad2/3-niveauer var fraværende i myotubes behandlet med aav6-GDF11PRO-Fc, hvilket antyder, at GDF11PRO-Fc-ekspression antagoniserer GDF11/MSTN-induceret aktivering af SMAD2 / 3 i differentierede myotubes. Samlet set indikerer disse resultater, at GDF11PRO-Fc var i stand til at forhindre rgdf11 og rMSTN-induceret myotube-atrofi og inhibering af differentiering i c2c12-celler.

lokaliseret GDF11PRO-Fc-ekspression inducerer skeletmuskelhypertrofi hos voksne mus

tidligere har vi vist, at systemisk AAV-vektormedieret genlevering af GDF11PRO-Fc til neonatale mus førte til en signifikant stigning i hastigheden af skeletmuskelvækst . Det var imidlertid uklart fra denne undersøgelse, om GDF11PRO-Fc simpelthen forbedrede skeletmuskelvækst eller faktisk induceret skeletmuskelhypertrofi. Desuden var det ikke muligt at bestemme, om virkningerne af GDF11PRO-Fc blev medieret af lokal blokade af GDF11/MSTN i skeletmuskulatur, eller om de observerede effekter skyldtes systemisk modulering af GDF11/MSTN. For at løse disse spørgsmål vurderede vi virkningen af intramuskulær aav9-GDF11PRO-Fc administration hos voksne C57BL/6J mus. I disse undersøgelser blev kun højre bagben injiceret, og den kontralaterale venstre bagben blev brugt som kontrol.

kropsvægt steg lidt over tid hos mus behandlet med AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 10% efter 10 uger; p = 0,0418; Fig. 3a). Derudover blev greb med en enkelt bagben normaliseret til kropsvægt signifikant øget i begge lemmer testet individuelt med den større effekt, der blev set i det behandlede højre bagben (+ 37%; p = 0,0177), skønt der også blev observeret en signifikant stigning i normaliseret grebstyrke i det ubehandlede venstre bagben (+ 18%; p = 0,0426). Denne forskel nåede imidlertid ikke betydning, når begge baglemmer blev testet samtidigt (+ 15%; p = 0,2375; Fig. 3b). Ti uger efter vektoradministration var højre bagben synligt større hos mus behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). Hos mus behandlet med AAV9-GDF11PRO-Fc var vådvævsmassen af den injicerede højre tibialis anterior (+ 50%; p = 0,0046) og gastrocnemius (+37%; p = 0,0023) signifikant højere sammenlignet med køretøjsbehandlede kontroller. Der var ingen statistisk signifikant forskel i vådvævsmassen af de ubehandlede venstre bagbenmuskler (Fig. 3d). Myofiber arealanalyse afslørede en stigning i det gennemsnitlige myofiber tværsnitsareal (+ 15%; p = 0.0078) i aav9-GDF11PRO-Fc-injiceret højre side gastrocnemius (Fig. 3 E og f). MFD-distributionsanalyse afslørede også et skift mod større myofibre i højre side gastrocnemius af mus injiceret med aav9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3G), hvilket indikerer, at lokaliseret GDF11PRO-Fc-ekspression inducerede muskelhypertrofi. I en separat kohorte vurderede vi også virkningen af lokaliseret genlevering af GDF11 ved en intramuskulær injektion af AAV9-GDF11 i højre bagben, og signifikant muskelatrofi blev observeret 10 uger efter behandling i det injicerede bagben (yderligere fil 1: Figur S4).

GDF11PRO-Fc inducerer lokaliseret skeletmuskelhypertrofi efter intramuskulær genlevering. 8 uger gamle C57BL / 6J-mus blev behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 5) eller vehikel (n = 5) via ensidig intramuskulær injektion i højre bagben. Den kontralaterale venstre bagben blev ikke behandlet. Mus blev aflivet 10 uger efter behandlingen. en gennemsnitlig kropsvægt over tid. B Hindlimb greb styrke normaliseret til kropsvægt ved 10 uger efter behandling. Vist er målinger fra en enkelt bagben og begge bagben. C repræsentativ brutto hindlimb muskulatur. Den injicerede baglim er betegnet med en sort pil. d Vægt af tibialis anterior og gastrocnemius. e repræsentative immunofluorescensbilleder af injicerede gastrocnemius-tværsnit i højre side farvet med Aleksafluor-488-konjugeret VGA for at visualisere myofibre. Skalestænger repræsenterer 100 liter. f gennemsnitlig myofiber tværsnit område i den injicerede højre side gastrocnemius. g myofiber MFD fordeling i den injicerede højre side gastrocnemius. Der blev målt mindst 500 myofibre pr.mus. h vestlig blot identifikation af GDF11PRO-Fc i vævslysater fra injicerede højre side gastrocnemius og leverprøver af behandlede mus. GDF11PRO-Fc kunne ikke påvises i vehikelbehandlede mus. Lige proteinbelastning blev verificeret ved Ponceau s-farvning, og GAPDH blev anvendt som belastningskontrol. Alle fejlbjælker repræsenterer middelkurs sem. *p <0.05; **p < 0.01; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med køretøjsbehandlet kontrol. TA tibialis anterior, Gas gastrocnemius

vestlig blot-analyse viste, at GDF11PRO-Fc-proteinet blev udtrykt i aav9-GDF11PRO-Fc-injiceret højre side gastrocnemius (58 kDa-bånd; Fig. 3h). GDF11PRO-Fc kunne imidlertid ikke påvises i den ubehandlede venstre side gastrocnemius ved den samme totale proteinmængde indlæst, hvilket antyder, at størstedelen af skeletmuskulatur GDF11PRO-Fc-ekspression var lokaliseret til det injicerede højre bagben (data ikke vist). GDF11PRO-Fc kunne også påvises i leveren ved vestlig blot, hvilket indikerer, at der var forekommet en vis systemisk eksponering (Fig. 3h). Denne observation kan sandsynligvis tilskrives vaskulær lækage af aav9-vektoren i systemisk cirkulation fra injektionsstedet . Ud fra disse data bestemmer vi, at GDF11PRO-Fc inducerer skeletmuskelhypertrofi hos voksne mus. Derudover medieres disse virkninger i det mindste delvist af lokal blokade af GDF11/MSTN på skeletmuskulatur, sandsynligvis via hæmning af ligandinteraktioner med ActRII på skeletmuskelvæv.

systemisk GDF11PRO-Fc-genafgivelse øger knoglemuskelmasse og styrke hos mus

dernæst evaluerede vi virkningen af systemisk GDF11PRO-Fc-ekspression hos mus for at bestemme, om GDF11PRO-Fc også kunne inducere hypertrofi og øge styrken i dystrofisk skeletmuskulatur. Med henblik på dette forsøg blev GDF11PRO-Fc-konstruktionen modificeret med en mutation for at gøre den uigennemtrængelig for endogen bmp1/TLD-lignende metalloproteinase spaltning (GDF11PRO-Fc D122A) og øge faktor persistens i systemisk cirkulation . Til disse eksperimenter blev både aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A evalueret for at fastslå, om den muterede d122a transgen ville føre til en mere udtalt effekt in vivo. For at opnå systemisk ekspression blev mus behandlet med vektor eller vehikel ved haleveinjektion. Efter intravenøs levering transducerer aav9-vektoren muselever med høj effektivitet. Transducerede hepatocytter kan derefter udtrykke transgen og udskille proteinproduktet i systemisk cirkulation .

fra 3 uger efter injektion observerede vi en signifikant stigning i kropsvægt, der varede i løbet af forsøget med aav9-GDF11PRO-Fc (+ 7, 7% efter 12 uger; p = 0, 0094) og aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% efter 12 uger; p = 0, 006) behandling (Fig. 4a). Det skal bemærkes, at på grund af den dystrofiske patologi udviser mdks-mus typisk kompenserende muskelhypertrofi, som delvis kan maskere stigningen i muskelmasse induceret af GDF11PRO-Fc-ekspression. Med hensyn til muskelfunktionstest viste behandlede mus øget forben greb styrke, selv efter normalisering til kropsvægt. Forskellen i normaliseret forbenets grebstyrke nåede imidlertid kun statistisk signifikans i aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen. 12 uger efter behandlingen blev den gennemsnitlige normaliserede grebstyrke på forbenet øget med + 28% (p = 0,0873) og + 36% (p = 0,0248) hos mus behandlet med henholdsvis aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A (Fig. 4b). Rotarod ydeevne blev også forbedret ved aav9-GDF11PRO-Fc D122A behandling i gennemsnit (+93% stigning i rotarod latenstid; p = 0,0127). Rotarod-ydeevnen blev også forbedret i aav9-GDF11PRO-Fc-gruppen, men denne forskel nåede ikke statistisk signifikans (+ 44% stigning i rotarod-latenstid; p = 0,2835; Fig. 4c). Der blev ikke observeret nogen forskel i løbebåndets køretid på tværs af nogen af grupperne (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc forbedrer grebsstyrken og rotarod-ydeevnen hos dystrofiske mus. 6 uger gamle mus blev behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), aav9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller vehikel (n = 7) via haleveinjektion. en gennemsnitlig kropsvægt over tid. B forben greb styrke normaliseret til kropsvægt over tid. C bedste rotarod tid til fald registreret fra forbehandling (baseline) og 12 uger efter behandling. Den bedste tid fra tre forsøg blev brugt til analyse. d Total afstandskørsel på løbebånd udholdenhedstest fra forbehandling (baseline) og 12 uger efter behandling. Alle fejlbjælker repræsenterer middelkurs sem. *p < 0.05; **p < 0.01; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med køretøjsbehandlet kontrol

i slutningen af 12-uge forsøg, muskelhypertrofi var tydeligt tydeligt i de behandlede mus (fig. 5a). Gennemsnitlige våde vævsmasser af tibialis anterior, gastrocnemius og kvadriceps blev øget med + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) og + 14% (p = 0.0333) henholdsvis i aav9-GDF11PRO-Fc-gruppen. I aav9-GDF11PRO-Fc d122a-gruppen blev disse værdier yderligere øget til + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) og + 23% (p = 0,0009) i forhold til vehikelbehandlet kontrol for ændringen i henholdsvis gennemsnitlig tibialis anterior mass, gastrocnemius mass og kvadriceps mass. Derudover blev membranvådvævsmassen øget med + 19% (p = 0,0162) og + 26% (p = 0,0014) i henholdsvis aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc d122a-grupperne. Interessant nok blev hjertemassen ikke signifikant ændret ved behandling. Det gennemsnitlige gastrocnemius myofiber-tværsnitsareal var højere hos mus behandlet med AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) og aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Fig. 5c og d). I MFD-distributionsanalysen havde MFD en tendens til at toppe omkring 20-30 liter på tværs af alle grupperne, hvilket sandsynligvis skyldes den højere andel af små regenererende myofibre i dystrofisk muskel. Imidlertid resulterede behandling med AAV9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A i en øget andel af myofibre med MFD ‘ er, der var højere end 64 liter, hvilket antydede, at faktorekspression havde induceret myofiber hypertrofi (Fig. 5e) i skeletmuskulatur.

GDF11PRO-Fc inducerer skeletmuskelhypertrofi hos dystrofiske mus. 6 uger gamle mus blev behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), aav9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller vehikel (n = 7) via haleveinjektion. Mus blev aflivet 12 uger efter behandlingen. en repræsentativ brutto hindlimb muskulatur. B vådt væv vægt af lemmer muskler, mellemgulv og hjerte. C repræsentative immunofluorescensbilleder af gastrocnemius tværsnit farvet med Aleksafluor-488-konjugeret VGA for at visualisere myofibre. Skalestænger repræsenterer 100 liter. d gennemsnitlig myofiber tværsnit område i gastrocnemius. e myofiber MFD distribution i gastrocnemius. Der blev målt mindst 500 myofibre pr.mus. f identifikation af GDF11PRO-Fc ved vestlig blot i levervævslysat og serum fra mus behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc. Lige proteinbelastning blev verificeret ved Ponceau s-farvning, og GAPDH blev anvendt som belastningskontrol i levervævslysater. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med køretøjsbehandlet kontrol

vestlig blot-analyse bekræftede proteinekspression af transgenerne i lever og serum. Som forventet kunne båndet ved 58 kDa svarende til fuld længde GDF11PRO-Fc eller GDF11PRO-Fc D122A påvises i behandlede mus. Serumniveauerne af propeptidet i fuld længde var lidt højere hos mus behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc D122A end hos dem, der blev behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc, hvilket antyder, at serumpersistensen af det aktive propeptid blev forøget med d122a-mutationen (Fig. 5f).

samlet set indikerer disse resultater systemisk ekspression af GDF11PRO-Fc og GDF11PRO-Fc D122A øger skeletmuskelmassen hos dystrofiske mus, og at denne skeletmuskelhypertrofi er forbundet med forbedringer i grebstyrke og motorisk koordination. Imidlertid, behandling syntes ikke at påvirke muskel udholdenhed baseret på løbebånd kører ydeevne. Derudover syntes d122a-mutanten at være lidt mere effektiv til at øge muskelmasse og funktion, formodentlig på grund af forbedret serumpersistens.

systemisk GDF11PRO-Fc-genlevering reducerer ikke den dystrofiske patologi hos mdks-mus

en række undersøgelser har rapporteret, at blokade af TGF-re-actrii-SMAD2 / 3-signalering, hvad enten det er ved mstn-hæmning eller blokade af ActRII, kan have terapeutisk fordel i dyremodeller af DMD . For at bestemme virkningen af aav9-GDF11PRO-Fc-behandling på den dystrofiske patologi udførte vi histologisk analyse af lemmer muskler og membranen.

karakteristiske tegn på dystrofisk patologi, herunder muskelnekrose, central nucleation, intramuskulær kollagenaflejring og tilstedeværelse af inflammatoriske infiltrater var tydelige på tværs af alle mdks-grupperne (Fig. 6a). I gastrocnemius blev den fibrotiske arealprocent reduceret med-39% (p = 0, 0273) hos mus behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc. Fibrose i gastrocnemius faldt også lidt i aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen; på grund af høj intersubject variabilitet i lemmer muskel intramuskulær fibrose nåede denne forskel imidlertid ikke statistisk signifikans (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). Der blev heller ikke observeret nogen signifikant forskel i andelen af centralt nukleerede myofibre, hvilket antyder, at myofiber-regenerering aktivt forekom på tværs af alle grupperne (Fig. 6c). Serum CK, en markør for muskelnedbrydning, blev heller ikke signifikant ændret ved behandling (Fig. 6d). Derudover var lokal forringelse af myofiber membranintegritet målt ved anti-mus IgG immunofluorescensfarvning tydelig på tværs af alle MDK-grupperne. Uventet udviste mus behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc D122A en lille stigning i IgG-positivt område i gennemsnit, men denne forskel nåede ikke statistisk signifikans (+ 55%; p = 0,1729; Fig. 6e og f; yderligere fil 1: Figur S5). Tydelige tegn på myofiber nekrose, regenerering, central nukleation og IgG-penetrering var ikke tydelige i den vilde type C57BL/10J gastrocnemius, hvilket indikerer, at disse markører er specifikke for den dystrofiske patologi (Fig. 6a-f; yderligere fil 1: Figur S5).

GDF11PRO-Fc mildner ikke den dystrofiske patologi hos mdks-mus. 6 uger gamle mus blev behandlet med aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), aav9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller vehikel (n = 7) via haleveinjektion. Aldersmatchede C57BL / 10J (n = 5) mus blev også inkluderet som en vildtype kontrol. Mus blev aflivet 12 uger efter behandlingen. en repræsentativ He og MTC farvning fra gastrocnemius tværsnit af C57BL / 10J og mdks mus. Central nucleation er tydelig i alle MDK-grupperne. Lokaliserede områder af myofiber nekrose og regenerering er markeret med en sort pil. Fibrotisk område er repræsenteret af den blå region på MTC-farvning. Vægtstænger repræsenterer 50 liter i HE-sektioner og 100 liter i MTC-sektioner. B fibrotisk område i gastrocnemius udtrykt som en procentdel af det samlede muskeltværsnitsareal. C procentdel af myofibre, der udviser central nucleation. D måling af cirkulerende niveauer af serum CK, en markør for muskelskade. e repræsentative immunofluorescensbilleder af mus IgG-farvning (rød) i gastrocnemius vævstværsnit. Positiv farvning for IgG indikerer myofiber permeabilitet for serumproteiner og tab af membranintegritet. Sektioner blev co-farvet med VGA for at visualisere individuelle myofibre. Området er markeret med en hvid boks. Karakteristiske IgG-positive myofibre er afbildet med en hvid pil. Skalestænger repræsenterer 100 liter. f området af IgG-positive myofibre udtrykt som en procentdel af det samlede muskeltværsnitsareal. g repræsentativ He-og MTC-farvning fra membrantværsnit af C57BL / 10J-og MDK-mus. Omfattende patologi er tydelig i MDK, men ikke C57BL/10J mus. Skalestænger repræsenterer 100 liter. h fibrotisk område i membranen udtrykt som en procentdel af det samlede tværsnitsareal. * p < 0.05; * * * p < 0.001; * * * * p < 0.0001; n.s. ikke signifikant;

i membranen afslørede h&e-farvning omfattende nekrose og intramuskulær kollagenaflejring i både behandlede og ubehandlede grupper (Fig. 6g). I lighed med det, der blev observeret i gastrocnemius-muskelen, frembragte behandling med aav9-GDF11PRO-Fc eller aav9-GDF11PRO-Fc D122A en mild reduktion i membran intramuskulær fibrose generelt. Den gennemsnitlige fibrotiske arealprocent i membranen blev reduceret med 15% (p = 0,0328) og 17% (p = 0.019) med henholdsvis aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A-behandling (Fig. 6h). Som forventet var disse patologiske træk stort set fraværende i membranen af vildtype C57BL/10J mus (Fig. 6g og h). Ud fra disse data bestemmer vi, at GDF11PRO-Fc og GDF11PRO-Fc D122A er i stand til mildt at hæmme intramuskulær kollagenaflejring i lemmernes muskler og membran over en 3-måneders periode. Behandling ser imidlertid ikke ud til at standse den igangværende cyklus af muskeldegeneration og regenerering i gastrocnemius eller membran hos voksne mus.