absorptionsspektre

absorptionsspektret af thiamin blev registreret mod vand (Figur 1), Det blev fundet, at thiamin udviser en maksimal absorptionstop (maks. På grund af stærkt blåforskudt maks.thiamin, dens bestemmelse i doseringsformen baseret på den direkte måling af dens absorption for ultraviolet er modtagelig for potentielle interferenser fra de almindelige hjælpestoffer. Derfor var derivatisering af thiamin for at opnå synlige områdeabsorberende arter utvivlsomt nødvendig. Således blev derivatisering af thiamin med NBD-Cl udført, og produktets absorptionsspektrum blev registreret mod reagensemne (Figur 1). Det blev konstateret, at produktet er brunfarvet, der udstiller krymaks ved 434 nm, og krymaks af NBD-Cl var 342 nm. Tiamin-NBD-Cl-derivatet blev rødforskudt, hvilket eliminerede enhver potentiel interferens. Bølgelængden 434 nm blev derfor fastsat som optimal.

optimering af reaktionsbetingelserne

Figur 1: absorptionsspektre af thiamin (3), NBD-Cl (2) og komplekset mellem dem (1).

de optimale betingelser for den udviklede metode blev etableret ved at variere parametrene en ad gangen, mens de andre parametre holdes konstante og efter den effekt, der udøves på absorbansen af det farvede produkt. For at etablere eksperimentelle betingelser blev effekten af forskellige parametre såsom pH, tid, buffervolumen og koncentration af NBD-Cl undersøgt.

effekt af pH

effekten af pH på reaktionen mellem thiamin og NBD-Cl blev testet ved at variere pH-formen 7,0 til 12,0. Som vist i figur 2 er absorbansen af produktet lav ved pH 7,0, hvilket indikerer, at thiamin ikke kan reagere med (NBD-Cl) i neutrale medier. Dette skyldtes muligvis eksistensen af aminogruppen af thiamin i form af hydrochloridsalt, hvilket hæmmer nukleofil substitutionsevne. Da pH steg fra 7 til 12, steg aflæsningerne dramatisk, hvilket frigav aminogruppen af thiamin og letter den nukleofile substitution. Den maksimale absorption blev opnået ved pH-værdi på 10,5. Ved pH-værdier mere end 10,5 forekom et fald i absorptionen. Dette blev sandsynligvis tilskrevet stigningen i mængden af hydroksidion, der øger hastigheden af den tilbagestående reaktion af thiamin med NBD-Cl.

effekt af reaktionstid

reaktionsproduktets absorbans blev overvåget på forskellige tidspunkter (figur 3). Ved at holde andre forhold intakte blev absorbansen af reaktionsproduktet fulgt efter at have stået i forskellige tidsintervaller ved 25 kg C. resultaterne viser, at thiamin reagerer med NBD-Cl ved 25 kg C, og absorbansen begynder at stige gradvist og nå et maksimum efter 25 minutter. Ved længere reaktionstider blev der observeret et let fald i absorbansen. Følgelig blev 25min indstillet som den passende reaktionstid til bestemmelse.

effekt af mængden af bufferen

figur 2: effekt af pH på reaktionen af thiamin med NBD-Cl.
thiamin (20 g/ml): 1 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (vægt/v), reaktionstid 20 min.

figur 3: effekt af reaktionstid på reaktionen af thiamin med NBD-Cl.
thiamin (20 liter / ml): 1 ml, Buffer (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-Cl conc. 0, 2% (vægt/vægt).

Ved at holde pH ved 10,5 blev effekten af mængden af bufferopløsning på absorbansen af reaktionsproduktet også undersøgt (figur 4). Figuren afslører, at absorbansen af reaktionsproduktet forøges hurtigt med stigningen i mængden af bufferopløsning og bliver maksimal, når mængden af bufferopløsning når 1,5 mL. Derfor blev mængden af 1,5 mL bufferopløsning valgt for at sikre den højeste absorbans.

effekt af NBD-Cl-koncentration

undersøgelsen af effekten af NBD-Cl-koncentrationer viste, at reaktionen var afhængig af reagenskoncentrationen. Den højeste absorptionsintensitet blev opnået ved NBD-Cl-koncentration på 0,2% (vægt/v), og højere koncentration af NBD-Cl fører til et fald i absorbansen (figur 5).

fra ovenstående parametre-justeringseksperimenter var de optimerede betingelser, der blev anvendt til analysen: pH 10,5, NBD-Cl-koncentration 0,2% (vægt/v), volumen af bufferen 1,5 mL, reaktionstid 25min og temperatur 25 liter.

figur 4: effekt af Buffermængde (ml) på reaktionen af thiamin med NBD-Cl.
thiamin (20 liter/ml): 1 ml, Buffer pH: 10,5, NBD-Cl conc. 0, 2% (vægt/v), reaktionstid 25 min.

figur 5: effekt af NBD-Cl koncentration på dens reaktion med thiamin.
thiamin (20 liter/ml): 1 ml, Buffer (pH 10,5): 1,5 ml, reaktionstid 25 min.

validering af metoden

metoden blev valideret for følgende parametre: specificitet, linearitet, Præcision, nøjagtighed, detektionsgrænse (LOD), kvantificeringsgrænse (lok) og robusthed i henhold til International Conference on harmonisation (ICH) retningslinjer .lineariteten blev evalueret ved lineær regressionsanalyse bestemt ved at konstruere syv koncentrationer af thiamin i området 05–35 pr.ml, som blev beregnet ved den mindste kvadratiske regressionsmetode til beregning af kalibreringsligningen og korrelationskoefficienten. Kalibreringskurverne blev konstrueret ved at plotte koncentration versus absorbans ved hjælp af lineær regressionsanalyse. Regressionsligningen for resultaterne var a=0,033 * – 0,009 (r2=0,999), hvor A er absorbansen ved 434 nm, H er koncentrationen af thiamin i lengg/mL i området 05-35 lengg/mL, og R er korrelationskoefficient (tabel 1). Det blev fundet, at det lineære koncentrationsområde er sammenligneligt med vores tidligere metode ved hjælp af NKV . Detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (Lok) blev bestemt efter følgende formel LOD=3.3 lp SDa / b, og LP=10 lp SDa/b, SDa er standardafvigelsen for skæringspunktet; b er hældningen under ICH-retningslinjerne . LOD og Lok viste sig at være henholdsvis 0,667 og 2,020 liter/mL (tabel 1).

nøjagtighed

nøjagtigheden af den foreslåede metode blev udført ved at anvende 3 forskellige koncentrationer 10, 20 og 30 liter / mL thiaminlægemiddel inden for lineært område beregnet som procentdelen af lægemidlet, der blev genvundet fra prøverne (tabel 2).

relativ fejl (RE) var inden for 0,24% med tilsvarende standardafvigelse inden for 0,004 for tre forskellige bestemmelser (tabel 3).

robusthed

reaktionsmekanisme: det er rapporteret, at NBD-Cl reagerer med aminogruppe af primære eller sekundære aminderivater . Tilsvarende aminogruppe af thiamin kan fungere som en nukleofil på grund af det ensomme par elektroner på nitrogenatomet, der trender til at angribe på det elektronmangel center i NBD–Cl (Tabel 4 & figur 6). Samtidig er det blevet bevist, at produktets sammensætning er 1:1 af thiamin og NBD-Cl (Figur 7). Så det konkluderes, at aminogruppe af thiamin reagerer med NBD-Cl for at danne en brun addukt. Reaktionsligningen er vist i Figur 7.

figur 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

anvendelse af den foreslåede metode til analyse af thiamindoseringsform

Thiamintabletter blev underkastet analysen ved den foreslåede, og etiketkravet stemmer Godt overens med vores nye metode som vist i tabel 5. Den foreslåede metode har den fordel, at den næsten er fri for interferenser af hjælpestoffer.

Figure 7: Reaktion af thiamin med NBD-Cl viser 1: 1 støkiometri.