spektrofotometer Med enkel stråle og dobbel stråle. Et dobbeltstrålespektrofotometer sammenligner lysintensiteten mellom to lysbaner, en bane som inneholder en referanseprøve og den andre prøven. Et enkeltstrålespektrofotometer måler strålens relative lysintensitet før og etter at en prøve er satt inn. Selv om sammenligningsmålinger fra dobbeltstråleinstrumenter er enklere og mer stabile, kan enkeltstråleinstrumenter ha et større dynamisk område og er optisk enklere og mer kompakte. I tillegg er noen spesialiserte instrumenter, som spektrofotometre bygget på mikroskoper eller teleskoper, enkeltstråleinstrumenter på grunn av praktiske egenskaper.Historisk sett bruker spektrofotometre en monokromator som inneholder et diffraksjonsgitter for å produsere det analytiske spektret. Gitteret kan enten være bevegelig eller fast. Hvis en enkelt detektor, for eksempel et fotomultiplikatorrør eller fotodiode brukes, kan gitteret skannes trinnvis (skannespektrofotometer) slik at detektoren kan måle lysintensiteten ved hver bølgelengde(som tilsvarer hvert «trinn»). Arrays av detektorer (array spektrofotometer), for eksempel charge coupled devices (CCD) eller photodiode arrays (PDA) kan også brukes. I slike systemer er gitteret fast og intensiteten til hver bølgelengde av lys måles av en annen detektor i matrisen. I tillegg bruker de fleste moderne mid-infrarøde spektrofotometre En Fourier-transformasjonsteknikk for å skaffe seg spektralinformasjonen. Denne teknikken kalles Fourier transform infrarød spektroskopi.

når man foretar overføringsmålinger, sammenligner spektrofotometeret kvantitativt lysfraksjonen som passerer gjennom en referanseløsning og en testløsning, sammenligner deretter intensiteten til de to signalene elektronisk og beregner prosentandelen av overføring av prøven sammenlignet med referansestandarden. For refleksjonsmålinger sammenligner spektrofotometeret kvantitativt lysfraksjonen som reflekterer fra referanse – og testprøver. Lys fra kilden lampen føres gjennom en monokromator, som diffracts lyset inn i en «regnbue» av bølgelengder gjennom en roterende prisme og utganger smale båndbredder av denne diffracted spekteret gjennom en mekanisk spalte på utgangssiden av monokromatoren. Disse båndbreddene overføres gjennom testprøven. Deretter måles fotonfluxtettheten (watt per meter kvadrert vanligvis) av det overførte eller reflekterte lyset med en fotodiode, ladekoblet enhet eller annen lyssensor. Transmisjons-eller refleksjonsverdien for hver bølgelengde av prøveprøven blir deretter sammenlignet med overførings-eller refleksjonsverdiene fra referanseprøven. De fleste instrumenter vil bruke en logaritmisk funksjon til det lineære transmittansforholdet for å beregne prøvens absorpsjon, en verdi som er proporsjonal med konsentrasjonen av kjemikaliet som måles.

kort sagt er hendelsesforløpet i et skannespektrofotometer som følger:

1. lyskilden skinte i en monokromator, diffrakt i en regnbue, og delt i to bjelker. Det skannes deretter gjennom prøven og referanseløsningene.
2. Fraksjoner av hendelsesbølgelengder overføres gjennom eller reflekteres fra prøven og referansen.
3. det resulterende lyset treffer fotodetektorenheten, som sammenligner den relative intensiteten til de to bjelkene.
4. Elektroniske kretser konverterer de relative strømmene til lineære overføringsprosenter og/eller absorbans / konsentrasjonsverdier.

i et matrisespektrofotometer er sekvensen som følger:det overførte lyset brytes inn i en regnbue med refleksjonsgitteret

Mange eldre spektrofotometre må kalibreres ved en prosedyre kjent som «nullstilling», for å oppnå en høyere effekt.balanse nullstrømutgangen til de to bjelkene ved detektoren. Overføringen av et referansestoff er satt som en baseline (datum) verdi, slik at overføringen av alle andre stoffer registreres i forhold til det opprinnelige «nullet» stoffet. Spektrofotometeret konverterer deretter overføringsforholdet til ‘absorpsjon’, konsentrasjonen av spesifikke komponenter i testprøven i forhold til det opprinnelige stoffet.Spektrofotometri Er en viktig teknikk som brukes i mange biokjemiske eksperimenter som involverer DNA, RNA og proteinisolasjon, enzymkinetikk og biokjemiske analyser. Siden prøver i disse applikasjonene ikke er lett tilgjengelige i store mengder, er de spesielt egnet til å bli analysert i denne ikke-destruktive teknikken. I tillegg kan dyrebare prøven lagres ved å benytte en mikro-volum plattform hvor så lite som 1uL av prøven er nødvendig for komplette analyser. En kort forklaring på prosedyren for spektrofotometri inkluderer å sammenligne absorpsjonen til en tom prøve som ikke inneholder en farget forbindelse til en prøve som inneholder en farget forbindelse. Denne fargen kan oppnås ved Enten Et fargestoff som Coomasie Brilliant Blue G-250 fargestoff målt ved 595 nm eller ved en enzymatisk reaksjon som sett mellom β-galaktosidase OG ONPG (blir prøve gul) målt ved 420 nm.: 21-119 spektrofotometeret brukes til å måle fargede forbindelser i det synlige lysområdet (mellom 350 nm og 800 nm),: 65 dermed kan det brukes til å finne mer informasjon om stoffet som studeres. I biokjemiske eksperimenter velges en kjemisk og / eller fysisk egenskap, og prosedyren som brukes er spesifikk for den egenskapen for å utlede mer informasjon om prøven, for eksempel mengde, renhet, enzymaktivitet etc. Spektrofotometri kan brukes til en rekke teknikker som å bestemme optimal bølgelengdeabsorbans av prøver, bestemme optimal pH for absorbans av prøver, bestemme konsentrasjoner av ukjente prøver og bestemme pKa av forskjellige prøver.:21-119 Spektrofotometri er også en nyttig prosess for proteinrensing og kan også brukes som en metode for å lage optiske analyser av en forbindelse. Spektrofotometriske data kan også brukes sammen Med Beer-Lambert − Ligningen, A = -log 10 ⁡ t = ϵ c l = o d {\textstyle A=-\log _{10}t=\epsilon cl=OD}

, for å bestemme ulike forholdet mellom transmisjon og konsentrasjon, og absorbans og konsentrasjon.:21-119 fordi et spektrofotometer måler bølgelengden til en forbindelse gjennom fargen, kan en fargestoffbindende substans tilsettes slik at den kan gjennomgå en fargeendring og måles. Det er mulig å kjenne konsentrasjonene av en to-komponentblanding ved hjelp av absorpsjonsspektrene til standardløsningene til hver komponent. For å gjøre dette er det nødvendig å kjenne utryddelseskoeffisienten til denne blandingen ved to bølgelengder og utryddelseskoeffisientene til løsninger som inneholder de kjente vektene til de to komponentene. Spektrofotometre har blitt utviklet og forbedret over flere tiår og har blitt mye brukt blant kjemikere. I tillegg Er Spektrofotometre spesialisert på å måle ENTEN UV – eller Synlig lysbølgelengdeabsorbansverdier.:21-119 det anses å være et svært nøyaktig instrument som også er veldig følsomt og derfor ekstremt presist, spesielt for å bestemme fargeendring. Denne metoden er også praktisk for bruk i laboratorieforsøk fordi det er en billig og relativt enkel prosess.