Mobilfasen

mobilfasen i omvendt fasekromatografi er en blanding av vann eller buffer med et polar organisk løsningsmiddel som metanol, acetonitril, isopropanol (IPA) eller tetrahydrofuran (THF). Elueringsstyrken øker omtrent i denne rekkefølgen. Alkoholene er protondonorer mens acetonitril er en protonacceptor. Acetonitril / vannblandinger har lavere viskositet sammenlignet med blandinger av de andre løsningsmidlene med vann. Dette resulterer i et lavere tilbaketrykk. IPA / vannblandinger har den høyeste viskositeten. På grunn av det lavere tilbaketrykket som skyldes lavere viskositet, er de to vanligste organiske mobilfasemodifikatorene acetonitril og metanol. Acetonitril har også lav absorpsjon i lav UV, mye mindre enn de andre løsningsmidlene.

Vann er den svakeste eluenten i omvendt fasekromatografi. Tilsetningen av metanol eller acetonitril reduserer retensjonen. Logaritmen til retensjonsfaktoren reduseres omtrent i forhold til konsentrasjonen av organisk løsningsmiddel. Hvis analytten er et lite molekyl som det er tilfelle for de fleste legemidler, vil retensjonen reduseres omtrent syvfoldig når konsentrasjonen av metanol i mobilfasen øker med ca 20%. I metodeutvikling) antas det at det er et lineært forhold mellom logaritmen til retensjonsfaktoren og volumfraksjonen av den organiske modifikatoren i mobilfasen. Men man bør bare vurdere dette som en god tommelfingerregel, som ikke er nøyaktig eller teoretisk forsvarlig.

På grunn av løsningsegenskapene til acetonitril sammenlignet med metanol, resulterer erstatning av ett løsningsmiddel med det andre ofte i en endring i elueringsordren til analyttene (Figur 2). Derfor er denne teknikken ofte brukt i metodeutvikling. Endringen fra en modifikator til en annen skaper mer signifikante selektivitetsendringer enn endringen av løsningsmiddelstyrken alene (dvs. ved å endre bare konsentrasjonen av det organiske løsningsmidlet). THF endrer også selektiviteten drastisk. Faktisk er de største selektivitet endringene ofte forårsaket ved å erstatte noen metanol eller acetonitril MED THF. Men av flere grunner som sin ubehagelige lukt, dannelsen av peroksider OG ugunstig UV-gjennomsiktighet, brukes den ikke veldig ofte.

Figur 2. Innflytelse av mobilfasemodifikatoren på selektiviteten til separasjonen. Topp, acetonitril; bunn, metanol. Kolonne: XTerra RP18, 4.6 mm×50 mm, 3.5 µ. Gradient ved 2 ml min-1 over 15 min fra 0 til 80% organisk ved pH 3 med ammoniumformiat. Analytter: 1, triamteren; 2, klortalidon; 3, althiazid; 4, furosemid; 5, benztiazid; 6, probenecid; 7, etakrynsyre; 8, bumetanid; 9, canrenoic syre. (Kromatogram levert Av Diane Diehl Og Kim Tran, Waters Corporation.)

tolkningen av løsningsmiddelselektivitet kompliseres av det faktum at det organiske løsningsmidlet adsorberes av de stasjonære faseligandene og kan anses å være en del av den stasjonære fasen. Nylig har flere forfattere målt overflateoverskuddet av de organiske modifikatorene for standard c18-type stasjonære faser og har funnet signifikante forskjeller i overflateløsningen mellom acetonitril og metanol.Det ble nevnt i begynnelsen av denne delen at metanol gir høyere retensjon enn acetonitril. Dette er enda mer uttalt for ioniserte forbindelser enn for nonionized forbindelser. Dette gir mening ut fra standpunktet at den adsorberte metanol i den stasjonære fasen letter penetrasjonen av de ioniserte molekylene i den stasjonære fasen. Det samme mønsteret er funnet når metanol sammenlignes MED THF. Dette er nyttige funksjoner i metodeutvikling. På den annen side viser forbindelser med sulfonamidfunksjonelle grupper relativt mer retensjon I THF, sammenlignet med en gruppe referanseanalytter. Samlet sett kan en betydelig innflytelse av det organiske løsningsmidlet på selektiviteten til en separasjon observeres, men en rasjonalisering er vanskelig, siden løsningsmidlet kan finnes i både den stasjonære og mobile fasen. Noen forfattere har også forsøkt å skille høyt vanninnhold mobile faser fra lavt vanninnhold seg.

som nevnt ovenfor, er de viktige selektivitet forskjeller mellom de forskjellige løsemidler et meget nyttig verktøy i utviklingen av reversert-fase separasjoner. Klassiske metodeutviklingsordninger har brukt metanol, acetonitril og THF som organiske modifikatorer i mobilfasen. Mellomliggende selektiviteter kan oppnås med løsningsmiddelblandinger, og en justering av toppavstand kan oppnås uten vanskeligheter. Moderne metodeutviklingsordninger bruker temperatur som en annen lett kontrollerbar variabel i justeringen av selektivitet.et viktig aspekt ved mobilfasens selektivitet er dens pH. kontrollen av retensjonen av ioniserbare forbindelser ved hjelp av buffere eller syre-eller baseadditiver til mobilfasen er svært viktig. Ved å velge mobilfasens pH, kan man lette manipuleringen av retensjon og selektivitet. Som nevnt ovenfor kan forskjellen i retensjon mellom den ioniserte og den ikke – ioniserte formen av en analytt være 10 til 30 ganger, og pH-kontroll er viktig.

i de senere år har forskning vist at både pH og ioniseringskonstantene til bufferen endres når organiske løsningsmidler legges til det. Dette har viktige konsekvenser for kontroll av oppbevaring. Man kan vanligvis komme til en definert ionisering av analytten hvis pH i mobilfasen er ±2 pH-enheter vekk fra analyttens pka. Men hvis pH og analytt pKa både endrer seg med tilsetning av organisk løsningsmiddel, er dette ikke lett å håndtere ved hjelp av enkle regler. Derfor er en god pH-kontroll og en god buffer viktige elementer i reproduserbarheten av en reversert faseseparasjon av ioniserbare analytter. PH måles i vann, hvor man er kjent med pKa-verdiene til de vanlige bufferne, og man foretrekker å holde seg nær disse pKa-verdiene. Maksimal bufferkapasitet er funnet på pKa av bufferen. Mens pH endres i nærvær av det organiske løsningsmidlet, gjør bufferkapasiteten ikke. For utøveren av omvendt fasekromatografi er dette et viktig aspekt ved retensjonskontroll. På den annen side må etterforskeren av reverserte faseretensjonsmekanismer være forberedt på å måle pH i nærvær av det organiske løsningsmidlet for fullt ut å forstå dens innflytelse på retensjon. Vanligvis resulterer tilsetningen av det organiske løsningsmidlet i en økning i pka av syrer, og i en reduksjon i pKa for baser. Dette gjelder både buffere og analytter. Dette kan resultere i et betydelig skifte i det forventede ioniseringsmønsteret til en analytt. Her er et eksempel som illustrerer dette: et amin med en pKa på 9 er fullstendig ionisert i en fosfatbuffer ved pH 7 i vann, men det kan bare være halv ionisert i samme buffer etter tilsetning av 70% metanol. Det er klart at slike effekter er signifikante. Derfor er en nøyaktig måte å forberede en buffer og å kontrollere dens pH avgjørende for en god kontroll av reversert fase retensjon av ioniserbare analytter.

Andre ioniske interaksjoner påvirker retensjonen og selektiviteten til en reversert faseseparasjon av ioniserte analytter også. Et klassisk verktøy for å øke retensjonen av ioniske analytter er ion-par kromatografi. I denne teknikken balanseres den stasjonære fasen med en hydrofob ladet ion, slik som en langkjedet sulfonsyreion (f.eks. oktylsulfonat) eller en hydrofob kvaternær amin (f. eks. tetrabutylammoniumion). En typisk mobilfasekonsentrasjon er rundt 10 mM. tilsetningen av ionparreagenset til mobilfasen øker retensjonen av målioner, reduserer retensjonen av ioner med samme ladning som ionparreagenset, og etterlater retensjonen av nøytrale analytter, inkludert zwitterions, nesten upåvirket. Dermed er det et utmerket verktøy for å justere selektiviteten til en separasjon. Årsaken til disse endringene i selektiviteten er det faktum at ionparreagenset adsorberes på overflaten av den stasjonære fasen. Den enkleste tolkningen av den resulterende retensjonsmekanismen er en kombinasjon av ionbytter med reversert fasemekanisme. Etter hvert som konsentrasjonen av ion-parreagenset i mobilfasen øker, øker retensjonen av motsatt ladede analytter først, og deretter avtar ved høyere konsentrasjoner. For ioneparreagenser med forskjellig kjedelengde øker retensjonen raskere med lengre kjedelengde.En annen ion-interaksjonseffekt som oppstår med kationiske analytter er økningen i retensjon når små uorganiske moterioner legges til mobilfasen. Konsentrasjonene som kreves er vanligvis omtrent 10 ganger høyere enn konsentrasjonene som brukes med ioneparreagenser. Typiske anioner av denne typen er perklorat (ClO4−), tetrafluoroborat (BF4−) eller heksafluorofosfat (PF6−). De øker retensjonen av kationiske analytter betydelig. Effekten er mer uttalt med acetonitril som mobilfase additiv enn med metanol. Dette forklares av et tykkere lag av acetonitril adsorbert på den stasjonære fasen sammenlignet med et monomolekylært lag av metanol og partisjoneringen av tellerionen i dette laget. Fra brukerens synspunkt er retensjonsadferden til kationiske analytter i nærvær av disse uorganiske anioner ikke ulik den som observeres med ekte ionparreagenser, dvs.med langkjedede sulfonsyrer.