Plantemateriale

Observasjoner og kjemiske analyser ble gjennomført fra 2011 til 2018 på en samling av planter dyrket i den eksperimentelle hagen Ved Universitetet Louvain-la-Neuve campus (50°39’55″N; 4°37’11″e). Før og under blomstringsperioden (juli–August) ble planter plassert I Universitetets vekstkamre under kontrollerte forhold (24/22 °C; 16 L:8d, RH 80 ± 10%).

Insektmateriale

de viktigste insektbesøkende artene Av a. napellus (a. mellifera, b. pascuorum og B. terrestris) ble brukt i forsøk på blomsters attraktivitet og gustatory preferanse. A. mellifera og b. pascuorum individer (10 per test og behandling) ble samlet i naturen rundt universitetsområdet (minst fire steder per art) om morgenen før testene. Som B. terrestris individer kan ikke lett skilles i feltet (lignende morfologi for flere arter), vi brukte humle fra fire elveblest (Biobest, Westerloo, Belgia) plassert i nærheten av universitetsbygningene for å skaffe personer til eksperimentering.

blomstertrekk

Pollentall

pollenknappene på 10 blomster i mannlige og kvinnelige faser ble samlet, talt, tørket og plassert på en sil (90 µ) for å gnides for å samle pollenkorn. Mengden pollenkorn ble veid. Pollen teller ble utført Ved Lille-1 University (Evo-Eco-Paleo Unit). Vi brukte en partikkelteller for å estimere antall pollenkorn i disse prøvene. Dagen før pollen teller, ble prøver plassert i en rørvarmer til det meste av etanolen fordampet. Vi tvang deretter anther dehiscence ved å plassere prøver i en ovn på 56 °c over natten. Vi tilsatte 1 mL destillert vann til hver pollenprøve. Rør ble deretter sonikert og vortexed for å skille pollenkorn fra støtfangerne og hverandre. Pollenløsning (200 µ) ble deretter fortynnet i 5 mL isotonisk målebuffer (CASY® ton). Partikkeltelleren analyserte tre 400-µ prøver fra pollensuspensjonen, og ga totalt partikkelantall i dette 1200 µ volum, samt antall i 400 størrelsesklasser fra 0.125 til 150 µ. Sammenligninger med blanke prøver tillot oss å identifisere topper av partikler, med størrelse fra 20 til 30 µ, som tilsvarer pollenkorn. Antall pollenkorn per anther ble estimert ved å multiplisere verdiene gitt av partikkeltelleren ved fortynningsforholdet (dvs.(1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Blomst farge og morfologi

vi målte floral trekk (corolla lengde, corolla diameter, floral farge, OG UV refleksjon) på 10 blomster per fase (fra 10 forskjellige individer). Hjelmbredde, corolla lengde og diameter ble målt med en kalliper. Vi målte tepal fargerefleksjonsspektrum ved hjelp av et fiberoptisk spektrometer (avaspec-ULS2048) og en xenonpulsert lyskilde (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Nederland). FOR UV-refleksjonsmålinger ble blomster festet på en svart bakgrunn og fotografert Med En Nikon D40 (Kyst Optisk 60 mm 1:4 UV-VIS-IR ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

Floral flyktige samling

vi samplet flyktige organiske forbindelser (Voc) fra intakte mannlige og kvinnelige fase blomster (N = 4 for hver fase). Hver blomst ble individuelt satt inn i en glasspære (50 mm lengde og 30 mm diameter), med en 17 mm diameter åpning. For å forhindre luftforurensning ble et teflon-rør fylt med aktivt kull koblet til den ene enden av glasspæren og to Glass Tenax TA-rør (6 mm × 4 mm, 7 tommer; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgia) ble koblet til den andre enden. Tenax-rørene ble koblet til kalibrerte luftpumper (Gilair plus, Sensidyn, St. Petersburg, USA) med en strømningshastighet på 50 mL·min−1 i 180 min (mellom 11:00 og 14:00 h). Laboratorieforholdene varierte mellom 21,5 Og 23,5 °C med 45 til 55% RF.

Fangede Voc-Er ble deretter termisk desorbert på En Agilent 6800 gasskromatograf utstyrt med En Gerstel TDU−termodesorpsjonsenhet og CIS-kryokooler opprettholdt ved -50 °C. Umiddelbart etter termodesorpsjon ble CIS-enheten T° programmert fra -50 °C til 300 °C ved 12 °c sec-1. GLC-apparatet ble koblet Til Et Agilent 7975 c massespektrometer. Analytiske forhold var som følger: injeksjon i delt modus (med delt ratio på 50: 1, helium ved 1,6 mL min-1 som bærergass), VF-Max MS 30 m x 250@m (df = 0,25 µ) kolonne (Agilent). Temperaturen programmet gir det beste separasjon (foreløpige tester ikke vist) ble løst som følger: 40 °C (5 min) og deretter til 75 °C ved 4 °C min−1 og til 115 °C (3 °C min−1) og til slutt til 250 °C 13 °C min−1. MS forholdene var som følger: EI-modus ved 70 eV, KILDE T° = 250 °C, MS quadrupole ved 200 °C og skannet masseområde 35 til 500 amu.

de registrerte kromatogrammene ble systematisk tolket for å søke Etter Voc-er som er spesifikke for mannlige eller kvinnelige faser. Når det ble oppdaget, ble molekylene identifisert i henhold til beregnede databaser (Wiley 250.L og PAL 600). Identifikasjonene ble bekreftet basert på retensjonsdata for rene molekyler kommersielt tilgjengelige. De ble også kvantifisert i forhold til svært ren intern standard (limonene, 1 µ metanoloppløsning ved 0.67 ④g µ 1 legges automatisk til hvert desorpsjonsrør før termisk prosess).

Omgivende luft ble også samlet som en kontroll for å identifisere bakgrunnsforurensninger. For å forhindre et mulig gjennombrudd ble en andre glasspatron lastet med Samme adsorbent (Tenax TA) systematisk plassert i tandem. Analysen avslørte ikke noen spor av molekylene av interesse.

Alkaloid innsamling og analyser

Pollenkorn Ble samlet fra 50 blomster (fra 10 individer), tørket og deretter knust på en sil (90 µ) for å samle pollenkorn. Tre replikater av 15 mg pollen ble samplet for alkaloider. Prøvene ble frosset (-80 °C) i 2 timer og deretter frysetørket. Tørre prøver ble malt til et fint pulver med flytende nitrogen, og veide mengder pulver ble plassert i et 1,5 mL mikrosentrifugerør (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Alkaloider ble ekstrahert ved hjelp av en vevshomogenisator (Vwr Ultrasonisk Renere) for 10 min i 100 µ av ekstraksjonsbuffer (70% vandig metanol og 0,5% maursyre). Etter sentrifugering ved 12.000 rpm i 5 min (Sentrifuge 5430 R) ble supernatanten overført til et 1,5 mL mikrosentrifugerør. Etter tørking i En SpeedVac ble alkaloider resuspendert i 200 µ AV LC-MS-grad metanol og filtrert med et 0,45-µ PTFE sprøytefilter (Whatman).

Nektar ble samlet i 5-µ glasskapillærrør (Hirschmann Laborgerä, Eberstadt, Tyskland) fra 50 blomster (fra 10 individer). Tre replikater av 15 µ av nektar ble tørket I En SpeedVac og resuspendert i 200 µ av LC-MS-grad metanol før filtrering med et 0,45-µ PTFE sprøytefilter (Whatman).Kjemiske analyser ble utført ved hjelp AV ET LC-MS / MS-system bestående av En Thermo Accela-pumpe, autosampler, fotodiode-array-detektor og En Thermo Scientific LTQ orbitrap XL massedetektor (MASSMET, Louvain Drug Research Institute, Woluwe, Belgia). En Phenomenex Gemini c18 kolonne ble brukt (2 mm × 150 mm, fullpakket med 3-µ partikler). Et binært løsemiddelsystem med en strømningshastighet på 300 µ min−1 ble brukt: løsemiddel a, hplc-grad vann (0,1% maursyre); og løsemiddel B, LC-MS-grad metanol (0 min: 95% a, 10-12 min: 0% a, 13-17 min: 95% a). Et 10-µ volum ble injisert og kolonnetemperaturen ble satt til 30 °C. MS Med høy oppløsning ble utført med en elektrospray ioniseringskilde i positiv modus. Følgende innløpsbetingelser ble anvendt: kapillær temperatur, 275 °C; kapillær spenning, 13 V; rørlinse, 140 V; skjede gassstrøm, 30 au; og hjelpegasstrøm, 10 ua. datainnsamling og behandling ble utført Med xcalibur-programvare. Denne metoden dekket massespekteret av alle alkaloider (MW fra 329 til 673). Alkaloider fra pollen og nektar ble oppdaget og forsøksvis identifisert av høyoppløselig MS. Fragmentering oppnådd ved kollisjon-indusert dissosiasjon hjulpet i identifisering. Alkaloidkonsentrasjoner ble beregnet basert på en akonitinstandardkurve I MeOH og uttrykt som «akonitinekvivalent». Analyserte alkaloider ble valgt basert på deres tilstedeværelse i Andre Aconitum arter4, 8.

Nektarproduksjon og sukkersammensetning

Nektar ble samlet i 5-µ glasskapillarrør (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Tyskland) fra blomster av plantene overført i vekstkamrene på Universitetsområdet (ingen insektbesøk). Vi estimerte nektarproduksjonstrenden i løpet av dagen i begynnelsen av anthesis ved å prøve 2 blomster fra 12 personer hver 2.time i løpet av 10 timer. Vi målte også den totale nektarproduksjonen per blomst (2 blomster fra 12 individer) for de samme blomstene hver 2.dag i løpet av hele (9 dager) blomstens levetid, på samme tid hver dag, 2 timer etter at lyset ble slått på. Total produksjon for mannlige og kvinnelige faser ble estimert fra prøvetaking ved slutten av hannfasene (5 dager etter anthesis) og hunnfasene (8 dager).

Nektarprøver ble lagret ved -80 °C inntil kjemiske analyser ble utført. Etter avledning ble sukkeridentifikasjon og kvantifisering utført AV GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). En Restek RXI-5SIL MS (30 m x 0.25 mm ID, 0.25 µ df) kolonne ble brukt. Strømningshastigheten var 1,0 mL min-1 (helium). Delt ratio injisert var 1/10 for heksosene og 1/100 for sukrose. Følgende innløpsbetingelser ble anvendt: ovnstemperatur, 105 °C i 4 min, deretter til 280 °C ved 15 °C Min-1 (i 20 min) og injektortemperatur på 250 °C.Det totale sukkerinnholdet i nektar per blomst (mg) ble deretter beregnet som volum av nektar (µ) x total sukkerkonsentrasjon (mg/µ).

Insektadferd

i 2011 og 2012 fant undersøkelser sted i de fire gjenværende naturlige populasjonene I fens I Sør-Belgia. Av disse inneholder naturreservatet «Les Abattis» (49°40’50″N; 5°32’59″E) den største og tetteste befolkningen (2970 m2 med 1330 ± 1030 a. napellus blomster m−2). På «Fouches» (49°4’8″N; 5°43’06″E), som har den nest største befolkningen (1788 m2), individer Av A. napellus var svært spredt over området og med mye lavere tettheter (176 ± 177 blomster m−2) «Chantemelle’ (49°39’37″N; 5°39’37″E)’ hadde en diskontinuerlig befolkning bestående av tre flekker (161, 423 og 500 m2) med relativt lave plante−og blomstertettheter (179 ± 125 blomster m-2). «Sainte-Marie»(49°40’06″N; 5°32’56» E) hadde en liten og ujevn befolkning (292 m2, 152 ± 163 blomster m−2) som strekker seg ca 150 m langs et tidligere jernbanespor.Blomstersøkende ble registrert i 10-min observasjoner under toppblomstring på tre påfølgende dager i 2011 (mellom 30. August og 3. September) og på fire dager i 2012 (mellom 21.og 27. August) med tørre og varme værforhold. Andelen mannlige faseblomster, i disse dager og i alle populasjoner, var høyere enn kvinnelige faseblomster (ca 85%). Blomster innen 1 m2 (eller omtrent fem planter) ble observert samtidig. Minst ti observasjoner per populasjon ble utført (maksimum 16), fordelt over hele populasjonen og over ulike tider i løpet av dagen. For hver besøkende registrerte vi arten, antall ranede og ubebodde blomster besøkt per plante og lapp, tid brukt per enkeltblomst samt deres foraging oppførsel (pollen eller nektar samling, legitim eller illegitim besøk, referert til som rane (base-working, primær og sekundær rane). I løpet av 530 min med blomsterobservasjoner i 2011 og 400 min i 2012 registrerte vi 183 blomsterbesøkende. Humler (b. pascuorum og b. hortorum) og honningbier (Apis mellifera) var de viktigste blomst besøkende; bare 3 b. terrestris individer ble observert.

Pollenbærende kapasitet

Tretti individer per art ble drept med etylacetat og individuelt lager. Pollen ble fjernet fra de forskjellige insektsdelene med små kuber av gelatin-glycerin53. Pollenkorn konsentrert i corbicula ble fjernet og ikke inkludert i analyser. Alle pollenkornene ble talt ved lysmikroskopi.

polleninnsamling renhet

vi samplet pollenbelastninger fra humle som besøkte a. napellus i de naturlige populasjonene. I laboratoriet ble pollenbelastninger acetolysed53. Minst 400 tilfeldig valgte pollenkorn av hver av de 25 pollenbelastningene ble identifisert og talt under lysmikroskopi.

Gustatory svar av insekt besøkende

vi fulgte protokollen Av Ma et al.54 for akonitin deteksjon. Når fanget, ble enkelte bier sultet i 3 timer i et plastflaske (7 cm langt, 2, 8 cm indre diameter) ved romtemperatur og i fullstendig mørke i laboratoriet. Vi overførte hver bi til et holderør, et 15 mL sentrifugerør med et 4 mm hull boret på spissen og et stykke stålnett festet innvendig. Etter en pre-testfase med en dråpe sukrose presenterte vi testløsningen i et 100-µ glasskapillarrør og klemte forsiktig slangen for å opprettholde løsningen på tuppen av røret. Ethvert insekt uten proboscis forlengelse etter 5 minutter ble fjernet fra testen. Testfasene var 2 minutter lange, og volumet av løsningen før og etter testen ble registrert med en kalliper.

Tester ble utført med tre besøkende arter (a. mellifera, b. pascuorum og B. terrestris). Ti individer per insektarter ble testet med hver løsning. Konsentrasjonene av sukrose (430 hryvnias mg−1) og akonitin (232 µ g−1) samsvarer med de som finnes i vår art. Tre løsninger ble presentert: deionisert vann alene (kontroll), ren sukroseoppløsning og sukrose pluss akonitinoppløsning.

for alle tester ble det beregnet en avskrekkingsindeks for hvert emne fra valg av drikke, volumet av oppløsning som forbrukes og tidspunktet for kontakt med løsningen som følger: ID = 1 – (valg for sukrose/valg for sukrose + akonitin) × (volum konsumert sukrose/volum konsumert sukrose + akonitin) × (kontakttid med sukrose oppløsning / kontakttid med sukrose + akonitin oppløsning).

Statistiske analyser

normaliteten av dataene ble estimert Ved Hjelp Av Shapiro-Wilk-tester, og homoskedastisitet ble verifisert ved Hjelp Av Levenes tester. Når normalitet og homosedastisitet krav ble oppfylt, analyser av varians (ANOVAs) ble utført (floral fase effekt på floral volatiler). Ellers ble ikke-parametriske tester utført Ved Bruk Av Wilcoxon-test for sammenligning av to forhold (blomsterfaseeffekt på blomstermorfologi og nektarparametere) og Kruskall-Wallis-test for sammenligning av mer enn to forhold (insekt-og løsningseffekt på konsumert volum og kontaktvarighet med løsningen i gustatoriske eksperimenter, insekteffekt på besøksadferd) og chi-kvadratiske tester ble utført for å sammenligne prosentene av individer i gustatoriske eksperimenter. ANOVA og ikke-parametriske analyser ble fulgt av multi parvis sammenligning når mer enn to forhold ble sammenlignet. Alle analysene ble utført I SAS Enterprise Guide 7.1. Dataene presenteres som et middel til standardavvik.