Gjennomføring av HPLC

Introduksjon

Høy ytelse væskekromatografi er i utgangspunktet en svært forbedret form for kolonnekromatografi. I stedet for at et løsningsmiddel får lov til å dryppe gjennom en kolonne under tyngdekraften, blir det tvunget gjennom under høyt trykk på opptil 400 atmosfærer. Det gjør det mye raskere.

Den lar deg også bruke en veldig mye mindre partikkelstørrelse for kolonnepakkematerialet som gir et mye større overflateareal for interaksjoner mellom den stasjonære fasen og molekylene som strømmer forbi den. Dette tillater en mye bedre separasjon av komponentene i blandingen.

den andre store forbedringen over kolonnekromatografi gjelder deteksjonsmetodene som kan brukes. Disse metodene er svært automatiserte og ekstremt følsomme.

kolonnen og løsningsmidlet

Forvirrende er det to varianter i BRUK I HPLC avhengig av den relative polariteten til løsningsmidlet og den stasjonære fasen.

Normal fase HPLC

Dette er egentlig bare det samme som du allerede har lest om i tynnlagskromatografi eller kolonnekromatografi. Selv om DET er beskrevet som «normalt», er DET ikke DEN mest brukte formen FOR HPLC.

kolonnen er fylt med små silikapartikler, og løsningsmidlet er for eksempel ikke-polar-heksan. En typisk kolonne har en indre diameter på 4,6 mm (og kan være mindre enn det), og en lengde på 150 til 250 mm.

Polare forbindelser i blandingen som føres gjennom kolonnen vil holde seg lenger til polar silika enn ikke-polare forbindelser vil. De ikke-polare vil derfor passere raskere gjennom kolonnen.

Reversert fase HPLC

i dette tilfellet er kolonnestørrelsen den samme, men silisiumet er modifisert for å gjøre det ikke-polart ved å feste lange hydrokarbonkjeder til overflaten – typisk med enten 8 eller 18 karbonatomer i dem. Et polært løsningsmiddel brukes – for eksempel en blanding av vann og en alkohol som metanol.

I dette tilfellet vil det være en sterk tiltrekning mellom det polare løsningsmidlet og polare molekyler i blandingen som føres gjennom kolonnen. Det vil ikke være så mye tiltrekning mellom hydrokarbonkjedene festet til silika (den stasjonære fasen) og de polare molekylene i løsningen. Polare molekyler i blandingen vil derfor bruke mesteparten av tiden på å bevege seg med løsningsmidlet.

Ikke-polare forbindelser i blandingen vil ha en tendens til å danne attraksjoner med hydrokarbongruppene på grunn av van Der Waals dispersjonskrefter. De vil også være mindre løselige i løsningsmidlet på grunn av behovet for å bryte hydrogenbindinger når de klemmer seg inn mellom vann-eller metanolmolekylene, for eksempel. De bruker derfor mindre tid i oppløsning i løsningsmidlet, og dette vil bremse dem ned på vei gjennom kolonnen.

det betyr at nå er det polare molekyler som vil reise gjennom kolonnen raskere.

Reversert fase HPLC er DEN mest brukte formen FOR HPLC.