GDF11PRO-Fc bindes til BÅDE GDF11 og MSTN

for å vise AT GDF11PRO-Fc kan sekvestrere muskelmassen.aktiv MODEN GDF11 dimer via en direkte INTERAKSJON, VI FORSØKTE å identifisere et protein-protein interaksjon mellom gdf11 og gdf11pro-fc. I tillegg, på grunn av den nære strukturelle homologien TIL GDF11 og mstn modne dimerer, ønsket vi også å avgjøre OM GDF11PRO-Fc forbinder MED MSTN. For å identifisere disse protein-protein-interaksjonene utførte vi et sett med nedtrekksanalyser(Fig. 1). Ligandene rGDF11, rMSTN og rActivin a ble inkubert med lysatfraksjoner FRA HEK293-celler transfisert med en plasmid-koding FOR GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc ved pH 7,4. På grunn av De konjugerte Fc-fragmentene på de modifiserte propeptidene, kunne fraksjoner trekkes ned direkte på et protein a / G agaroseharpiks. SOM forventet trakk GDF11PRO-Fc effektivt ned både rGDF11 og rMSTN, noe som indikerte AT GDF11PRO-Fc var i stand til å binde begge ligander. I TILLEGG trakk MPRO-Fc også ned både rGDF11 og rMSTN. BÅDE GDF11PRO-Fc og MPRO-Fc klarte ikke å trekke ned den fjernere relaterte tgf-β superfamily ligand rActivin A, noe som indikerte at ligandbinding er spesifikk (Fig. 1). INGEN binding AV GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN Eller rActivin a ble observert på en kontroll agaroseharpiks uten protein A / G. FRA disse resultatene konkluderer VI AT GDF11PRO-Fc spontant assosierer MED de modne GDF11-og MSTN-dimerne ved fysiologisk pH.

GDF11PRO-Fc assosierer MED GDF11 og MSTN. Protein – protein-interaksjoner MELLOM GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc og rGDF11, rMSTN Eller rActivin a ble bestemt ved en nedtrekksanalyse. GDF11PRO-Fc eller MPRO-Fc ble inkubert med rGDF11, rMSTN eller rActivin A i 1 h ved 4 °C. Fc-smeltede proteinkomplekser ble separert på en protein A / G-belagt agaroseharpiks og eluater ble kjørt på en 12% sds-SIDE gel under reduserende forhold og undersøkt av western blot. Inngangskontroll var 5% av inngangsmaterialet. WB western blot

GDF11PRO-Fc blokker GDF11/MSTN-indusert atrofi I C2C12 myotubes

Tillegg av rGDF11 og rMSTN til differensierte myotubes har tidligere vist seg å indusere atrofi i murine C2C12 og primære menneskelige skjelett MYOTUBES . Etter å ha fastslått AT GDF11PRO-Fc binder GDF11 og MSTN, spurte vi neste OM GDF11PRO-Fc kunne forhindre GDF11 / MSTN-indusert myotube atrofi i differensierte C2C12 myotubes. FOR å oppnå dette pakket VI DNA-sekvenskodingen FOR GDF11PRO-Fc inn I AAV6-kapsid for å generere aav6-GDF11PRO-Fc-vektoren. I disse forsøkene ble aav6-vektoren valgt for sin evne til effektivt og selektivt å transdusere differensierte C2C12 myotubes, men ikke myoblaster . C2C12 myoblaster ble dyrket og differensiert i 5 dager før behandling med AAV6-GDF11PRO-Fc eller aav6-EGFP (kontrollvektor) ved EN MOI på 105 (Fig. 2a). SOM forventet VAR GFP-uttrykk observerbart I C2C12 myotubes infisert MED AAV6-EGFP ved 48-72 h etter infeksjon, og kvantifisering av internaliserte vektorgenomkopier per diploid genom ved 72 h etter infeksjon indikerte at vektortransduksjon var tilstrekkelig oppnådd(Fig . 2b og c).

GDF11PRO-Fc blokker GDF11 / MSTN-indusert myotube atrofi I C2C12 celler. En Skjematisk detaljering eksperimentell tidslinje I C2C12 myotubes. AAV6-EGFP eller AAV6-GDF11PRO-Fc ble lagt TIL C2C12 myotubes ved EN MOI på 105 på dag 5 etter differensiering og 100 ng / ml rGDF11 eller rMSTN ble lagt til på dag 7. Myotubes ble farget og analysert på dag 10. b EGFP uttrykk var tydelig ved 48-72 h I C2C12 myotubes behandlet MED AAV6-EGFP (MOI 10 ). Skala barer representerer 50 µ c Vektor genom kopi nummer per diploid genom I C2C12 myotubes 72 h etter tillegg AV AAV6-EGFP eller AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). D Representative immunfluorescens bilder AV C2C12 myotubes. C2C12 myotube membraner ble visualisert ved farging med et anti-dystrofin antistoff (rød). Kjerner ble farget MED dapi (blå). Innfelt viser et zoomet område. Vektstenger representerer 50 µ (hovedpanel) og 25 µ (panelinnsats). e fraksjonen av kjerner innlemmet i myotubes (differensieringsindeks) ble beregnet og presentert som en prosentandel av kontroll. f Gjennomsnittlig myotube diameter i forhold til kontroll og (g) fordeling av diameter målinger. For målinger av myotube diameter ble hver myotube målt på tre punkter langs lengden av myotube og i gjennomsnitt. h Antall kjerner innlemmet per myotube. Minst 50 myotubes ble analysert per eksperimentell tilstand. i pSMAD2/3 i forhold til tSMAD2 / 3 ble vurdert av western blot. Lik protein lasting ble verifisert Av Ponceau s flekker OG GAPDH ble brukt som en lasting kontroll. Data representerer resultater fra tre separate eksperimenter. Alle feilfelt representerer middelmådig sem. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Syttito timer senere ble myotubene faste og farget for immunfluorescensanalyse ved hjelp av et antistoff som gjenkjenner dystrofin (rod 22/rod 23) for å visualisere myotube perifere membraner og DAPI for å plette myonuklei (Fig. 2d). En reduksjon i differensieringsindeksen, som er definert som andelen myonuklei inkorporert i myotubes, ble observert i myotubes behandlet med rGDF11 (- 15%, p = 0,0008) eller rMSTN (− 14%, p = 0,0013) i forhold til ubehandlet kontroll. Denne effekten ble imidlertid sløvet i GDF11PRO-Fc-ekspresjon C2C12 myotubes behandlet med rGDF11 (- 1,9%; p = 0.0047, sammenlignet med rgdf11− behandlet kontroll) eller rMSTN (- 3,0%; p = 0,0040, sammenlignet med rMSTN-behandlet kontroll; Fig. 2e). I TILLEGG motsto C2C12-myotuber som ble behandlet MED AAV6-GDF11PRO-Fc rgdf11-eller rMSTN-indusert myotubeatrofi. En signifikant reduksjon i gjennomsnittlig myotubediameter i forhold til kontroll ble påvist i myotubes behandlet med rGDF11 (- 39%; 0,0002) eller rMSTN (− 35%; p = 0,0003) sammenlignet med kontroll. Tvert imot, myotubes uttrykker GDF11PRO-Fc behandlet med rGDF11 (− 1,8%; p = 0,0005, sammenlignet med rgdf11-behandlet kontroll) eller rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, sammenlignet med rMSTN-behandlet kontroll) var i stor grad upåvirket (Fig. 2f og g). I et eget eksperiment VAR GDF11PRO-Fc ikke i stand til å forhindre rActivin A-indusert myotube atrofi, noe som er i tråd med observasjonen at GDF11PRO-Fc ikke binder activin A (Tilleggsfil 1: Figur S3).Behandling med rGDF11 eller rMSTN var også forbundet med en lavere andel modne myotuber med høyere antall myonuklei, noe som antyder en hemming av myotubedifferensiering. Myotuber med mer enn 11 myonuklei utgjorde bare 5,2% (p = 0,0215) og 7,2% (p = 0.0328) av myotubes analysert i celler behandlet med henholdsvis rgdf11 og rMSTN. Til sammenligning utgjorde myotubes med mer enn 11 kjerner 26% av myotubes analysert i kontroll myotubes. I myotuber som uttrykte GDF11PRO-Fc som ble behandlet med rgdf11 eller rMSTN, var andelen myotuber med mer enn 11 myonuklei henholdsvis 22% (p = 0,0104 sammenlignet med rgdf11-behandlet kontroll) og 19% (p = 0,0404 sammenlignet med rMSTN-behandlet kontroll) (Fig . 2h). Til slutt, i samsvar med hva som forventes etter GDF11/MSTN-signalering ved ActRII, var en økning I fosforylerte SMAD2/3 (pSMAD2/3) proteinnivåer i myotubes behandlet MED AAV6-EGFP og rGDF11 eller rMSTN observerbar på western blot 24 h etter tilsetning av ligand (Fig. 2i). Denne økningen i psmad2 / 3 nivåer var fraværende i myotubes behandlet MED AAV6-GDF11PRO-Fc, noe som tyder på AT GDF11PRO-Fc uttrykk motvirker GDF11 / MSTN-indusert aktivering AV SMAD2 / 3 i differensierte myotubes. Samlet sett indikerer disse resultatene AT GDF11PRO-Fc var i stand til å forhindre rGDF11-og rMSTN-indusert myotubeatrofi og hemming av differensiering I C2C12-celler.

LOKALISERT GDF11PRO-Fc-uttrykk induserer skjelettmuskelhypertrofi hos voksne mus

tidligere har Vi vist at systemisk aav-vektormediert genlevering AV GDF11PRO-Fc til neonatale mus førte til en signifikant økning i frekvensen av skjelettmuskelvekst . DET var imidlertid uklart fra denne studien om GDF11PRO-Fc bare forbedret skjelettmuskulaturvekst eller faktisk indusert skjelettmuskulaturhypertrofi. Videre var det ikke mulig å fastslå om EFFEKTENE AV GDF11PRO-Fc ble mediert ved lokal blokade AV GDF11 / MSTN i skjelettmuskulatur eller om de observerte effektene skyldtes systemisk modulering AV GDF11 / MSTN. For å løse disse spørsmålene evaluerte vi effekten av intramuskulær aav9-GDF11PRO-Fc administrasjon hos voksne c57bl / 6j mus. I disse studiene ble bare høyre bakbena injisert, og den kontralaterale venstre bakbena ble brukt som kontroll.

Kroppsvekten økte noe over tid hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc (+10% ved 10 uker; p = 0,0418; Fig. 3a). I tillegg ble grepsstyrken normalisert til kroppsvekt signifikant økt i begge lemmer som ble testet individuelt, med større effekt i behandlet høyre baklimb (+37%; p = 0,0177), selv om en signifikant økning i normalisert grepstyrke i ubehandlet venstre baklimb (+18%; p = 0,0426) også ble observert. Denne forskjellen nådde imidlertid ikke betydning når begge hindlimbene ble testet samtidig (+15%; p = 0,2375; Fig. 3b). Ti uker etter vektoradministrasjon var høyre baklimb synlig større hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig . 3c). Hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc var den våte vevsmassen til den injiserte høyre tibialis anterior (+ 50%; p = 0,0046) og gastrocnemius (+ 37%; p = 0,0023) signifikant høyere sammenlignet med kontroller behandlet med kjøretøy. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i den våte vevsmassen til de ubehandlede venstre baklimb-musklene (Fig. 3d). Myofiber områdeanalyse viste en økning i gjennomsnittlig myofiber tverrsnittsareal (+15%; p = 0.0078) I AAV9-GDF11PRO-Fc-injisert høyre gastrocnemius (Fig. 3 e og f). Mfd-distribusjonsanalyse viste også et skifte mot større myofibre i høyre gastrocnemius av mus injisert MED AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig . 3g), som indikerer at LOKALISERT GDF11PRO-Fc-uttrykk induserte muskelhypertrofi. I en egen kohort vurderte vi også virkningen av LOKALISERT genlevering AV GDF11 ved en intramuskulær injeksjon AV aav9-GDF11 i høyre hindlimb, og signifikant muskelatrofi ble observert 10 uker etter behandling i injisert hindlimb (Tilleggsfil 1: Figur S4).

GDF11PRO-Fc induserer lokalisert skjelettmuskelhypertrofi etter intramuskulær genlevering. 8 uker GAMLE c57bl/6j-mus ble behandlet MED aav9-GDF11PRO-Fc (n = 5) eller kjøretøy (n = 5) via ensidig intramuskulær injeksjon i høyre baklimb. Den kontralaterale venstre baklemmen ble ikke behandlet. Mus ble euthanized 10 uker etter behandling. en Gjennomsnittlig kroppsvekt over tid. B Hindlimb gripestyrke normalisert til kroppsvekt ved 10 uker etter behandling. Vist er målinger fra en enkelt hindlimb og begge hindlimbs. c Representant brutto hindlimb muskulatur. Den injiserte baklemmen er betegnet med en svart pil. d Våt vev vekt av tibialis anterior og gastrocnemius. E Representative immunfluorescensbilder av injiserte høyre gastrocnemius-tverrsnitt farget Med AlexaFluor-488-konjugert WGA for å visualisere myofibre. Skalastenger representerer 100@m. f Gjennomsnittlig myofiber tverrsnittsareal i injisert høyre gastrocnemius. g Myofiber mfd distribusjon i injisert høyre gastrocnemius. Minst 500 myofibre ble målt per mus. h Western blot identifikasjon AV GDF11PRO-Fc i vev lysater fra injisert høyre gastrocnemius og leverprøver av behandlede mus. GDF11PRO-Fc var ikke påviselig i kjøretøybehandlede mus. Lik protein lasting ble verifisert Av Ponceau s flekker OG GAPDH ble brukt som en lasting kontroll. Alle feilfelt representerer middelmådig sem. * p < 0,05; * * p < 0,01; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med kjøretøy-behandlet kontroll. TA tibialis anterior, gass gastrocnemius

Western blot analyse indikerte AT GDF11PRO-Fc protein ble uttrykt I AAV9-GDF11PRO-Fc-injisert høyre gastrocnemius (58 kda band; Fig. 3h). GDF11PRO-Fc var imidlertid ikke detekterbar i ubehandlet venstre gastrocnemius med samme totale proteinmengde lastet, noe som tyder på at flertallet AV SKJELETTMUSKULATUR GDF11PRO-Fc-uttrykk var lokalisert til injisert høyre baklimb (data ikke vist). GDF11PRO-Fc var også påviselig i leveren ved western blot, noe som indikerte at noe systemisk eksponering hadde forekommet (Fig. 3h). Denne observasjonen kan mest sannsynlig tilskrives vaskulær lekkasje AV aav9-vektoren i systemisk sirkulasjon fra injeksjonsstedet . FRA disse dataene bestemmer VI AT GDF11PRO-Fc induserer skjelettmuskelhypertrofi hos voksne mus. I tillegg er disse effektene i det minste delvis mediert ved lokal blokade AV GDF11 / MSTN på skjelettmuskulatur, sannsynligvis via hemming av ligandinteraksjoner med ActRII på skjelettmuskulaturvev.

Systemisk GDF11PRO-Fc genlevering øker skjelettmuskelmasse og styrke hos mdx-mus

Deretter evaluerte vi virkningen av systemisk GDF11PRO-Fc-uttrykk hos mdx-mus for å avgjøre OM GDF11PRO-Fc også kunne indusere hypertrofi og øke styrken i dystrofisk skjelettmuskulatur. I forbindelse med denne studien ble GDF11PRO-Fc-konstruksjonen modifisert med en mutasjon for å gjøre den ugjennomtrengelig for endogen BMP1/TLD-lignende metalloproteinasespaltning (GDF11PRO-Fc D122A) og øke faktor persistens i systemisk sirkulasjon . For disse forsøkene ble både AAV9-GDF11PRO-Fc og AAV9-GDF11PRO-Fc D122A evaluert for å fastslå om det muterte d122a transgen ville føre til en mer uttalt effekt in vivo. For å oppnå systemisk ekspresjon ble mdx-mus behandlet med vector eller vehicle ved haleinjeksjon. Etter intravenøs levering transduserer aav9-vektoren muselever med høy effektivitet. Transducerte hepatocytter kan deretter uttrykke transgen og utskille proteinproduktet i systemisk sirkulasjon .

fra 3 uker etter injeksjon observerte vi en signifikant økning i kroppsvekt som vedvarte i løpet av studien med AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% ved 12 uker, p = 0,0094) og aav9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% ved 12 uker, p = 0,006) behandling (Fig. 4a). Det skal bemerkes at mdx-mus på grunn av den dystrofiske patologien typisk utviser kompenserende muskelhypertrofi, noe som delvis kan maskere økningen i muskelmasse indusert AV GDF11PRO-Fc-uttrykk. Når det gjelder muskelfunksjonstester, viste behandlede mus økt forbenet grepstyrke, selv etter normalisering til kroppsvekt. Forskjellen i normalisert forben grepstyrke nådde imidlertid bare statistisk signifikans i aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen. Ved 12 uker etter behandling ble gjennomsnittlig normalisert forbenet grepstyrke økt med + 28% (p = 0,0873) og + 36% (p = 0,0248) hos mus behandlet med HENHOLDSVIS aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A (Fig . 4b). Rotarod-ytelsen ble også forbedret ved gjennomsnittlig BEHANDLING MED AAV9-GDF11PRO-Fc D122a (+93% økning i rotarod-latenstid, p = 0,0127). Rotarod-ytelsen ble også forbedret I aav9-GDF11PRO-Fc-gruppen, men denne forskjellen nådde ikke statistisk signifikans (+44% økning i rotarod latenstid; p = 0,2835; Fig. 4c). Det var ingen forskjell observert i tredemølle løpetid over noen av gruppene (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc forbedrer grepsstyrken og rotarod-ytelsen i dystrofiske mdx-mus. 6 uker gamle mdx-mus ble behandlet MED aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller kjøretøy (n = 7) via haleinjeksjon. en Gjennomsnittlig kroppsvekt over tid. B Forbein grep styrke normalisert til kroppsvekt over tid. C beste rotarod tid-til-fall registrert fra før behandling (baseline) og 12 uker etter behandling. Den beste tiden fra tre forsøk ble brukt til analyse. d Total distanse løp på tredemølle utholdenhetstest fra forbehandling (baseline) og 12 uker etter behandling. Alle feilfelt representerer middelmådig sem. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med kjøretøy-behandlet kontroll

på slutten av 12-ukestudie, muskelhypertrofi var grovt tydelig i de behandlede musene (fig. 5a). Gjennomsnittlig våt vevsmasse av tibialis anterior, gastrocnemius og quadriceps ble økt med + 17% (p = 0,0472), + 20% (p = 0,0011) og + 14% (p = 0.0333), henholdsvis I aav9-GDF11PRO-Fc-gruppen. I aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen ble disse verdiene ytterligere økt til + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) og + 23% (p = 0,0009) over kjøretøybehandlet kontroll for endring i gjennomsnittlig tibialis anterior masse, gastrocnemius masse og quadriceps masse, henholdsvis. I tillegg ble membranets våte vevsmasse økt med henholdsvis + 19% (p = 0,0162) og + 26% (p = 0,0014) i gruppene aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A. Interessant nok ble hjertemassen ikke signifikant endret ved behandling. Gjennomsnittlig gastrocnemius myofiber tverrsnittsareal var høyere hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) OG AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Fig. 5c og d). I mfd-distribusjonsanalysen hadde MFD en tendens til å ha en topp på rundt 20-30 µ i alle gruppene, noe som sannsynligvis skyldes den høyere andelen små regenererende myofibre i dystrofe muskler. Behandling MED AAV9-GDF11PRO-Fc og AAV9-GDF11PRO-Fc D122A resulterte imidlertid i en økt andel myofibre med Mfder høyere enn 64 µ, noe som tyder på at faktoruttrykk hadde indusert myofiberhypertrofi (Fig. 5e) i skjelettmuskulatur.

GDF11PRO-Fc induserer skjelettmuskelhypertrofi i dystrofiske mdx-mus. 6 uker gamle mdx-mus ble behandlet MED aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller kjøretøy (n = 7) via haleinjeksjon. Mus ble euthanized 12 uker etter behandling. En Representativ brutto hindlimb muskulatur. B Våt vev vekt av lemmer muskler, membran og hjerte. C Representative immunfluorescensbilder av gastrocnemius tverrsnitt farget Med AlexaFluor-488-konjugert WGA for å visualisere myofibre. Skalastenger representerer 100@m. D Gjennomsnittlig myofiber tverrsnitt område i gastrocnemius. e myofiber MFD distribusjon i gastrocnemius. Minst 500 myofibre ble målt per mus. F Identifikasjon AV GDF11PRO-Fc ved western blot i levervev lysat og serum hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc. Lik proteinbelastning ble verifisert Ved Ponceau s-farging og GAPDH ble brukt som lastekontroll i levervev lysater. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med kjøretøy-behandlet kontroll

western blot analyse bekreftet protein ekspresjon av transgene i lever og serum. Som forventet var bandet på 58 kDa som tilsvarer FULL LENGDE GDF11PRO-Fc eller GDF11PRO-Fc D122A detekterbart i behandlede mus. Serumnivåene av propeptidet i full lengde var noe høyere hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc D122A enn hos de som ble behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc, noe som tyder på at serumets varighet av det aktive propeptidet økte på grunn AV d122a-mutasjonen (Fig. 5f).Samlet sett indikerer disse resultatene systemisk ekspresjon AV GDF11PRO-Fc og GDF11PRO-Fc D122A øker skjelettmuskelmassen hos dystrofiske mdx-mus, og at denne skjelettmuskelhypertrofi er forbundet med forbedringer i grepstyrke og motorkoordinasjon. Imidlertid synes behandling ikke å påvirke muskel utholdenhet basert på tredemølle kjører ytelse. I tillegg syntes d122a mutanten å være litt mer effektiv for å øke muskelmassen og funksjonen, antagelig på grunn av forbedret serumkonsistens.

SYSTEMISK GDF11PRO-Fc gentilførsel reduserer ikke den dystrofiske patologien hos mdx-mus

en rekke studier har rapportert at blokade AV TGF-β-ActRII-SMAD2 / 3-signalering, enten VED mstn-hemming eller blokade av ActRII, kan ha terapeutisk nytte i DYREMODELLER AV DMD . For å bestemme effekten av AAV9-GDF11PRO-Fc-behandling på dystrofisk patologi, utførte vi histologisk analyse av lemmer og membran.Karakteristiske tegn på dystrofisk patologi, inkludert muskelnekrose, sentral kjernedannelse, intramuskulær kollagenavsetning og tilstedeværelse av inflammatoriske infiltrater, var tydelige i alle mdx-gruppene (Fig . 6a). I gastrocnemius ble den fibrotiske arealprosenten redusert med-39% (p = 0,0273) hos mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc. Fibrose i gastrocnemius ble også noe redusert I aav9-GDF11PRO-Fc D122A-gruppen; på grunn av høy intersubjektvariabilitet i intramuskulær fibrose i lemmer, oppnådde denne forskjellen imidlertid ikke statistisk signifikans (- 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). Det var heller ingen signifikant forskjell observert i andelen av sentralt nukleerte myofibre, noe som tyder på at myofiber regenerering var aktivt forekommende over alle gruppene (Fig. 6c). Serum CK, en markør for muskelbrudd, ble heller ikke signifikant endret ved behandling(Fig. 6d). I tillegg var lokalisert forverring av myofiber membranintegritet, målt ved anti – Mus IgG immunfluorescensfarging, tydelig over alle mdx-gruppene. Uventet viste mdx-mus behandlet MED AAV9-GDF11PRO-Fc D122A en liten økning i IgG-positivt område i gjennomsnitt, men denne forskjellen nådde ikke statistisk signifikans (+55%; p = 0,1729; Fig. 6e og f; Tilleggsfil 1: Figur S5). Åpenbare tegn på myofibernekrose, regenerering, sentral nukleasjon og IgG-penetrans var ikke tydelige i villtype c57bl/10J gastrocnemius, noe som indikerer at disse markørene er spesifikke for den dystrofiske patologien (Fig. 6a-f; Tilleggsfil 1: Figur S5).

GDF11PRO-Fc reduserer ikke den dystrofiske patologien i mdx-mus. 6 uker gamle mdx-mus ble behandlet MED aav9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) eller kjøretøy (n = 7) via haleinjeksjon. Alderstilpasset c57bl / 10j (n = 5) mus ble også inkludert som en vill type kontroll. Mus ble euthanized 12 uker etter behandling. En Representant HE og MTC flekker fra gastrocnemius tverrsnitt AV c57bl / 10j og mdx mus. Sentral nukleasjon er tydelig i alle mdx-gruppene. Lokaliserte områder av myofiber nekrose og regenerering er merket med en svart pil. Fibrotisk område er representert av den blå regionen PÅ MTC-farging. Vektstenger representerer 50 µ I HE-seksjoner og 100 µ i MTC-seksjoner. B Fibrotisk område i gastrocnemius uttrykt som en prosentandel av det totale muskeltverrsnittområdet. C Prosentandel av myofibre som viser sentral kjernedannelse. D Måling av sirkulerende nivåer av serum ck, en markør for muskelskade. E Representative immunfluorescensbilder av Mus IgG-farging (rød) i gastrocnemius vevstverrsnitt. Positiv farging For IgG indikerer myofiber permeabilitet for serumproteiner og tap av membranintegritet. Seksjoner ble kombinert MED WGA for å visualisere individuelle myofibre. Zoomet inn området er merket med en hvit boks. Karakteristiske IgG-positive myofibre er avbildet med en hvit pil. Skalastenger representerer 100@m. igg-positive myofibre uttrykt som en prosentandel av det totale muskeltverrsnittområdet. g Representant HE og MTC flekker fra membran tverrsnitt AV c57bl / 10j og mdx mus. Omfattende patologi er tydelig i mdx, men IKKE c57bl/10j mus. Skalastenger representerer 100@m. h Fibrotisk område i membranen uttrykt som en prosentandel av det totale tverrsnittsarealet. * p <0,05; ***p<0,0001; ****p< 0,0001; n.s. ikke signifikant; sammenlignet med kjøretøybehandlede mdx-kontroller

i membranen viste H & e-farging omfattende nekrose og intramuskulær kollagenavsetning i både behandlede og ubehandlede mdx-grupper (Fig. 6g). I likhet med det som ble observert i gastrocnemius-muskelen, ga behandling med AAV9-GDF11PRO-Fc eller AAV9-GDF11PRO-Fc D122A en mild reduksjon i membranens intramuskulære fibrose totalt sett. Den gjennomsnittlige fibrotiske arealprosenten i membranen ble redusert med 15% (p = 0,0328) og 17% (p = 0.019) med henholdsvis aav9-GDF11PRO-Fc og aav9-GDF11PRO-Fc D122A-behandling (Fig. 6h). Som forventet var disse patologiske egenskapene i stor grad fraværende i membranen av vill TYPE c57bl / 10j mus(Fig. 6g og h). FRA disse dataene bestemmer VI AT GDF11PRO-Fc og GDF11PRO-Fc D122A er i stand til mildt å hemme intramuskulær kollagenavsetning i lemmer og membran over en 3-måneders periode. Behandling ser imidlertid ikke ut til å stoppe den pågående syklusen av muskeldegenerasjon og regenerering i gastrocnemius eller diafragma hos voksne mdx-mus.