Figur 1: Absorpsjonsspekter Av Tiamin (3), NBD-Cl (2) og komplekset mellom dem (1).de optimale forholdene for den utviklede metoden ble etablert ved å variere parametrene en om gangen mens de andre parametrene var konstante og følge effekten som utøves på absorbansen av det fargede produktet. For å etablere eksperimentelle forhold ble effekten av ulike parametere som pH, tid, buffervolum og konsentrasjon AV NBD-Cl undersøkt.effekten av pH på reaksjonen mellom tiamin Og NBD-Cl ble testet ved å variere pH-formen 7,0 til 12,0. Som vist i Figur 2 er absorpsjonen av produktet lav ved pH 7,0, noe som indikerer at tiamin ikke kan reagere med (NBD-Cl) i nøytrale medier. Dette var muligens på grunn av eksistensen av aminogruppen tiamin i form av hydrokloridsalt, som hemmer nukleofil substitusjonsevne. Da pH økte fra 7 til 12, økte lesingene dramatisk, frigjorde aminogruppen av tiamin og letter den nukleofile substitusjonen. Maksimal absorpsjon ble oppnådd ved pH-verdi på 10,5. Ved pH-verdier over 10,5 oppstod en reduksjon i absorpsjonen. Dette ble tilskrevet sannsynligvis til økningen i mengden hydroksydion som øker hastigheten på tilbakereaksjonen av tiamin med NBD-Cl.

effekt av reaksjonstid

absorbansen av reaksjonsproduktet ble overvåket på forskjellige tidspunkter (Figur 3). Ved å holde andre tilstander intakte ble absorbansen av reaksjonsproduktet fulgt etter å ha stått i forskjellige tidsperioder ved 25°C. resultatene viser at tiamin reagerer MED NBD-Cl ved 25°C og absorbansen begynner å øke gradvis og nå et maksimum etter 25 minutter. Ved lengre reaksjonstider ble det observert en liten nedgang i absorbansen. Følgelig ble 25min satt som den praktiske reaksjonstiden for bestemmelse.

Effekt av mengden av bufferen

Figur 2: Effekt av pH på reaksjonen Av Tiamin MED NBD-Cl.
Tiamin (20µ / ml): 1 ml, NBD-Cl konc. 0,2% (w/v), reaksjonstid 20 min.

Figur 3: effekt av reaksjonstid på Reaksjonen Av Tiamin MED NBD-Cl.
Tiamin (20µ / ml): 1 ml, Buffer (pH 10.5): 1,5 ml, NBD-Cl konc. 0,2% (w / v).

Ved å Holde pH ved 10,5 ble effekten av mengde bufferoppløsning på absorbansen av reaksjonsproduktet også studert (Figur 4). Figuren viser at absorbansen av reaksjonsproduktet øker raskt med økningen av mengden bufferløsning, og blir maksimal når mengden bufferløsning når 1,5 mL. Derfor ble mengden av 1,5 mL bufferoppløsning valgt for å sikre den høyeste absorbansen.

EFFEKT AV NBD-Cl konsentrasjon

studien av effekten AV NBD-Cl konsentrasjoner viste at reaksjonen var avhengig av reagenskonsentrasjonen. DEN høyeste absorpsjonsintensiteten ble oppnådd VED NBD-Cl-konsentrasjon på 0,2% (w / v), og høyere konsentrasjon AV NBD-Cl fører til en reduksjon i absorbansen (Figur 5).

fra de ovennevnte parametrene-justeringsforsøkene var de optimaliserte forholdene som ble brukt for analysen: pH 10,5, NBD-Cl konsentrasjon 0,2% (w / v), volum av bufferen 1,5 mL, reaksjonstid 25min og temperatur 25º.

Figur 4: Effekt Av Buffermengde (ml) på Reaksjonen Av Tiamin MED NBD-Cl.
Tiamin (20µ / ml): 1 ml, Buffer pH: 10,5, NBD-Cl konc. 0,2% (w/v), reaksjonstid 25 min.

Figur 5: EFFEKT AV NBD-Cl konsentrasjon på sin reaksjon Med Tiamin.
Tiamin (20µ / ml): 1 ml, Buffer (pH 10,5): 1,5 ml, reaksjonstid 25 min.

Validering av metoden

metoden ble validert for følgende parametere: spesifisitet, linearitet, presisjon, nøyaktighet, grense for deteksjon (LOD), grense for kvantifisering (LOQ) og robusthet i Henhold Til International Conference on Harmonization (Ich) retningslinjer .

Linearitet, grense for deteksjon (LOD) grense for kvantifisering (LOQ)

lineariteten ble evaluert ved lineær regresjonsanalyse bestemt ved å konstruere syv konsentrasjoner av tiamin, i området 05–35µ / mL, som ble beregnet ved den minste kvadratiske regresjonsmetoden for å beregne kalibreringsligningen og korrelasjonskoeffisienten. Kalibreringskurvene ble konstruert ved å plotte konsentrasjon versus absorbans, ved hjelp av lineær regresjonsanalyse. Regresjonsligningen for resultatene var a=0,033 x – 0,009 (r2=0,999), Hvor A er absorbansen ved 434 nm, x er konsentrasjonen av tiamin i µ/mL i området 05-35 µ/mL, og r er korrelasjonskoeffisient (Tabell 1). Det ble funnet at det lineære konsentrasjonsområdet er sammenlignbart med vår tidligere metode ved BRUK AV NQS . Deteksjonsgrensen (lod) og kvantifiseringsgrensen (LOQ) ble bestemt I henhold til følgende formel LOD=3.3×SDa / b, OG LOQ=10×SDa / b, SDa er standardavviket til skjæringspunktet; b er skråningen i HENHOLD til ich-retningslinjene . LOD og LOQ ble funnet å være henholdsvis 0,667 og 2,020 µ/mL (Tabell 1).

Nøyaktighet

nøyaktigheten av den foreslåtte metoden ble utført ved å anvende 3 forskjellige konsentrasjoner 10, 20 og 30 µ/mL tiaminmedikament innenfor lineært område beregnet som prosentandel av legemidlet gjenvunnet fra prøvene (Tabell 2).

Sample No	Sample Content (µg/mL)	Thiamine Standard Amount (µg/mL)	Amount Found (Total) (µg/ml)	Recovery + SD*
				96.29+0.015
				98.90+0.018
				101.47+0.148

Table 2: Gjenopprettingsstudier for bestemmelse av tiamin ved den foreslåtte metoden.
*Verdier er gjennomsnitt av tre bestemmelser.Relativ feil (RE) var innenfor 0,24% med tilsvarende standardavvik innen 0,004 for tre forskjellige bestemmelser (Tabell 3).

Sample No	Concentration (μg/mL)	Concentration Found (μg/mL)	Recovery (% + SD)	Relative Error (%)
			95.5±0.004
			96.46±0.002
		97,50±0,003

tabell 3: evaluering av nøyaktighet og presisjon.

Robusthet

Reaksjonsmekanisme: DET er rapportert AT NBD-Cl reagerer med amingruppe av primære eller sekundære aminderivater . På samme måte kan aminogruppe av tiamin fungere som en nukleofil på grunn av det ensomme paret elektroner på nitrogenatomet, som trender for å angripe det elektron-mangelfulle senteret I NBD-Cl(Tabell 4 & Figur 6). Samtidig har det blitt bevist at sammensetningen av produktet er 1: 1 av tiamin Og NBD-Cl (Figur 7). Så det konkluderes med at aminogruppen tiamin reagerer MED NBD-Cl for å danne en brun addukt. Reaksjonsligningen er vist i Figur 7.

Figur 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

Parameter	Recovery (% ± SD)
Recommended condition	97.50±0.003
NBD-Cl concentration (0.22%)	98.75±0.002
NBD-Cl concentration (0.180%)	96.76%±0.003
Buffer PH(10,7)	96,90±0.002
Buffer PH(10,3)	95,79±0,22
reaksjonstid min (23)	96.09±0.009
reaksjonstid min (27)	98.01±0.003

tabell 4: påvirkning Av Liten VARIASJON i analysetilstanden på den analytiske ytelsen til den foreslåtte spektrofotometriske metoden for bestemmelse av tiamin ved bruk av nbd-cl reagens.

Anvendelse av den foreslåtte metoden til analyse av tiamin doseringsform

Tiamin tabletter ble utsatt for analysen av den foreslåtte og etiketten krav stemmer godt med vår nye metode som vist i Tabell 5. Den foreslåtte metoden har fordelen av å være praktisk talt fri for forstyrrelser av hjelpestoffer.

Brand Name of Label Claim (Mg)	Amount Found (Mg)	(% Found ± SD)a
Thiamine tablets (100 mg)		99.9±0.025

Table 5: Analysis of Thiamine-containing dosage form by the proposed method.
a: values are mean of five determinations.

Figure 7: Reaksjon Av Tiamin MED NBD-Cl som viser 1: 1 støkiometri.