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Aconitumの雄花は、花シグナルの増加と花粉媒介者への報酬で有毒な花粉を補う

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植物材料

2011年から2018年にかけて、ルーヴァン・ラ・ヌーブ大学キャンパス(北緯50°39’55″N;4°37’11”)の実験庭で栽培された植物のコレクションについて、観察と化学分析が行われました。e）。 開花前および開花期間（7月〜8月）の間に、植物を制御された条件下（24/22°C;16L：8D、RH80±10％）で大学の成長室に置いた。

昆虫材料

A.napellus（A.mellifera、B.pascuorum、およびB.terrestris）の主な昆虫の訪問者種は、花の魅力と味覚の好みの試験に使用されました。 A.melliferaおよびB.pascuorum個体（試験および治療ごとに10）は、試験前の午前中に大学キャンパス（種ごとに最小四つの場所）の周りの野生で収集されました。 Bとして terrestris個体はフィールドで容易に区別することはできません（いくつかの種の同様の形態）、我々は実験のための個人を得るために大学の建物の近くに配置された四つの巣箱（Biobest、Westerloo、Belgium）からマルハナバチを使用しました。

花の形質

花粉数

雄と雌の相で10花の葯を収集し、カウントし、乾燥し、花粉粒を収集するためにこするためにふるい（90μ m）に置かれました。 花粉粒の量を秤量した。 花粉数は、リール１大学（Ｅｖｏ−Ｅｃｏ−Ｐａｌｅｏ Ｕｎｉｔ）で実施した。 これらの試料中の花粉粒の数を推定するために粒子カウンタを使用した。 花粉の数の前日に、サンプルは、エタノールの大部分が蒸発するまでチューブヒーターに入れられた。 その後、一晩56℃のオーブンにサンプルを置くことによって葯の脱開を強制しました。 各花粉試料に1mLの蒸留水を加えた。 次いで、管を超音波処理し、葯および互いに花粉粒を分離するために渦状にした。 次いで、花粉溶液（２ ０ ０μ Ｌ）を、５ｍＬの等張測定緩衝液（ＣＡＳＹ（登録商標）ｔｏｎ）中で希釈した。 粒子カウンターは、花粉懸濁液からの400μ lサンプルを分析し、この1200μ l体積の総粒子数と、0.125から150μ mの範囲の400サイズクラスのカウントを提供しました。 ブランクサンプルとの比較では、花粉粒に対応する20-30μ mの大きさの粒子のピークを同定することができました。 葯あたりの花粉粒の数は、粒子カウンタによって提供された値に希釈比（すなわち、希釈比）を掛けることによって推定された。(1000/200) × (5000 + 200)/1200).

花の色と形態

私たちは、フェーズごとに10の花（10の異なる個人から）の花の特性（花冠の長さ、花冠の直径、花の色、およびUV反射率）を測定しました。 ヘルメットの幅、花冠の長さおよび直径はカリパスによって測定された。 我々は、光ファイバ分光計（Ａｖａｓｐｅｃ−ＵＬＳ２ ０ ４ ８）およびキセノンパルス光源（Ａｖａｌｉｇｈｔ−Ｘ Ｅ、Ａｖａｎｔｅｓ、Ａｐｅｌｄｏｏｒｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてｔｅｐａｌ色反射率スペクトルを測定した。 UV反射率測定のために、花を黒い背景に固定し、Nikon D40（Coastal Optical60mm1）で撮影しました。:４ＵＶ−ＶＩＳ−ＩＲ Ａｐｏｍａｃｒｏ；Ｆｉｌｔｒｅ Ｘ−Ｎｉｔｅ３ ３ ０）。

花の揮発性コレクション

我々は、無傷の雄相と雌相の花（各相のN=4）から揮発性有機化合物（VOCs）をサンプリングしました。 各花は、直径17mmの開口部を有するガラス球（長さ50mmおよび直径30mm）に個別に挿入された。 空気汚染を防止するために、活性炭を充填した１つのテフロン管をガラス球の一端に接続し、２つのガラスＴｅｎａｘ ｔ ａ管（６ｍｍ×４ｍｍ、７インチ、６ ０〜８ ０メッシュ、Ｇｅｒｓｔｅｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏｖｅｒｉｊｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を他端に接続した。 Ｔｅｎａｘ管を、較正空気ポンプ（Ｇｉｌａｉｒ ｐｌｕｓ，Ｓｅｎｓｉｄｙｎ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｂｕｓ，ＵＳＡ）に、５ ０ｍＬ＊分−１の流速で１ ８ ０分間（１ １：０ ０〜１ ４：０ ０時間）接続した。 実験室の条件は21.5と23.5°Cの間で45から55%RHの範囲だった。

トラップされたVocは、Gerstel TDU熱吸収ユニットと−50℃に維持CISクライオクーラーを取り付けたAgilent6800ガスクロマトグラフ上で熱脱着しました。 ＧＬＣ装置をＡｇｉｌｅｎｔ７ ９ ７ ５ｃ質量分析計に結合した。 分析条件は以下の通りであった：スプリットモード注入（スプリット比50：1、キャリアガスとして1.6mL分−1のヘリウム）、VF-Max MS30m x250μ m（df=0.25μ m）カラム（Agilent）。 最良の分離を可能にする温度プログラム（予備試験は示されていない）は、以下のように固定された：40℃（5分）、次いで4℃分−1で75℃、115℃（3℃分−1）、最後に13℃分−1で250℃ MS条件は以下の通りであった: 70eVでのEIモード、ソースT°=250°CでのMS四重極、200°Cでのスキャン質量範囲35 500amu。

記録されたクロマトグラムは、体系的に男性または女性の相に特異的なVocを検索するために解釈されました。 検出されると、分子は計算されたデータベース（Ｗｉｌｅｙ２ ５ ０．ＬおよびＰＡＬ６ ０ ０）。 同定は、市販されている純粋な分子の保持データに基づいて確証された。 それらはまた、非常に純粋な内部標準（リモネン、0で1μ lのメタノール溶液）に対して定量した。67µ g µ l1は自動的に熱プロセスの前に各脱着の管に加えられた）。

背景汚染物質を同定するために、周囲の空気も対照として収集した。 ブレークスルーの可能性を防ぐために、同じ吸着剤（Tenax TA）を搭載した第二のガラスカートリッジを体系的にタンデムに配置しました。 この分析では、関心のある分子の痕跡は明らかにされなかった。

アルカロイドの収集と分析

葯を50個の花（10個体から）から収集し、乾燥させた後、ふるい（90μ m）で粉砕して花粉粒を収集した。 花粉の15mgの三つの複製は、アルカロイドのためにサンプリングされました。 試料を２時間凍結（−８ ０℃）した後、凍結乾燥した。 乾燥試料を液体窒素で微粉末に粉砕し、秤量した量の粉末を1.5mLの微小遠心管（Eppendorf,Hamburg,Germany）に入れた。 アルカロイドは、組織ホモジナイザー（VWR超音波洗浄機）を使用して、100μ lの抽出緩衝液（70％メタノール水溶液および0.5％ギ酸）中で10分間抽出した。 １ ２，０ ０ ０ｒｐｍで５分間の遠心分離（遠心分離５ ４ ３ ０Ｒ）に続いて、上清を１． SpeedVacで乾燥した後、アルカロイドを200μ lのLC-MSグレードメタノールに再懸濁し、0.45μ m PTFEシリンジフィルター(Whatman)で濾過した。＜／ｐ＞＜ｐ＞蜜を５μ ｌのガラス毛細管（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ Ｌａｂｏｒｇｅｒａｔｅ，Ｅｂｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で５ ０個の花（１ ０個体から）から採取した。＜／ｐ＞＜Ｐ＞蜜を５μ ｌのガラス毛細管中で採取した。 ４ ５μ ｍ ＰＴＦＥシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）による濾過の前に、１ ５μ ｌの蜜の３つの複製物をＳｐｅｅｄｖａｃ中で乾燥させ、２ ０ ０μ ｌのＬＣ−ＭＳグレードメタノール中に再懸濁した。化学分析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ａｃｃｅｌａ ｐｕｍｐ、ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ、及びＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｘ Ｌ質量検出器（ＭＡＳＳＭＥＴ，Ｌｏｕｖａｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｏｌｕｗｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からなるＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いて行った。 Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１ ８カラムを使用した（２ｍｍ×１ ５ ０ｍｍ、３μ ｍ粒子を充填）。 １％ギ酸）；および溶媒Ｂ、ＬＣ−ＭＳ級メタノール（０分：９ ５％Ａ、１ ０〜１ ２分：０％Ａ、１ ３〜１ ７分：９ ５％Ａ）を使用した。 １ ０μ ｌの体積を注入し、カラム温度を３ ０℃に設定した。 以下の入口条件を適用した：毛細管温度、275°C;毛細管電圧、13V;チューブレンズ、140V;シースガス流量、30a.u.;および補助ガス流量、10u.a.データ収集および処理は、Xcaliburソフ この方法は、すべてのアルカロイド（329から673までのMW）の質量範囲をカバーした。 花粉と蜜からのアルカロイドを検出し、高分解能MSによって暫定的に同定した。 衝突誘起解離によって得られた断片化は同定に役立った。 アルカロイド濃度をＭｅｏｈ中のアコニチン標準曲線に基づいて計算し，”アコニチン当量”として表した。 分析されたアルカロイドは、他のAconitum種におけるそれらの存在に基づいて選択された4,8。

蜜の生産と糖組成

蜜は、大学のキャンパス（無昆虫訪問）の成長室で転送された植物の花から5μ lガラスキャピラリーチューブ（Hirschmann Laborgerate、Eberstadt、ドイツ）に収集しました。 私たちは、2時間ごとに12人から2時間ごとに10人の花をサンプリングすることによって、anthesisの開始時に日中の蜜の生産傾向を推定しました。 また、同じ花の花あたりの総蜜生産量（2個から12個）を2日ごとに測定し、花の寿命（9日）の間に、毎日同じ時間に、光がオンになった2時間後に測定しました。 男性と女性のフェーズの総生産は、男性（anthesis後5日）と女性（8日）のフェーズの終わりにサンプリングから推定されました。

蜜のサンプルは化学分析が行われるまで-80°cで貯えられました。 導出後、糖の同定および定量を、ＧＣ−ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ１ ３ １ ０／Ｔｈｅｒｍｏ ＩＳＱ−Ｑ Ｄ）によって行った。 Ｒｅｓｔｅｋ Ｒｘｉ−５ＳｉＬ ＭＳ（３ ０ｍ ｘ０． 流量は1.0mL min−1(ヘリウム)であった。 注入された分割比は、ヘキソースの場合は1/10、ショ糖の場合は1/100であった。 以下の入口条件を適用した：オーブン温度、105℃で4分間、次いで280℃で15℃分−1（20分間）および注入器温度250℃である。次いで、花当たりの蜜の総糖含量（ｍ ｇ）を、蜜の体積（μ ｌ）ｘ総糖濃度（ｍ ｇ／μ ｌ）として計算した。

昆虫の行動

2011年と2012年に、ベルギー南部のフェンスの残りの四つの自然集団で調査が行われました。 これらのうち、自然保護区”Les Abattis”（49°40’50″N;5°32’59″E）には、最大かつ最も密度の高い人口（2970m2、1330±1030A.napellus flowers m−2）が含まれています。 Fouches（49°4’8″N;5°43’06″E）では、2番目に大きな人口（1788m2）、Aの個体があります。 napellusは非常に地域に散在していたし、はるかに低い密度（176±177花m−2）で”Chantemelle’（49°39’37″N;5°39’37″E）”は、比較的低い植物と花の密度（179±125花m−2）と三つのパッチ（161、423、および500m2）からなる不連続な集団を持っていた。 “Sainte−Marie”（北緯49度40分06秒、東経5度32分56秒）は、かつての鉄道線路に沿って約150mにわたって伸びていた、小さくて斑状の人口（292m2、152±163m-2）を持っていた。

花の訪問者は、乾燥した暖かい気象条件で、2011年（月30日から月3日）と2012年（月21日から27日）のピーク開花時の10分間の観測で記録された。 これらの日の間およびすべての集団における雄相の花の割合は、雌相の花（約85％）よりも高かった。 1m2以内の花（または約五植物）が同時に観察された。 母集団ごとに最低10個の観察が行われ（最大16個）、母集団全体に広がり、日中は異なる時間にわたって広がった。 各訪問者について、種、植物およびパッチごとに訪問された奪われた花および奪われていない花の数、単一の花ごとに費やされた時間、およびその採餌行動（花粉または蜜の収集、正当または違法な訪問、強盗（ベースワーキング、一次および二次強盗）と呼ばれる）を記録した。 2011年には530分、2012年には400分の花の観察の間に、183人の花の訪問者を記録しました。 マルハナバチ（B.pascuorumとB.hortorum）とミツバチ（Apis mellifera）が主要な花の訪問者であり、3人のB.terrestris個体のみが観察された。

花粉運搬能力

種ごとに三十人が酢酸エチルで殺され、個別に貯蔵された。 花粉はゼラチン-グリセリンの小さな立方体で異なる昆虫の体の部分から除去された53。 Corbiculaに濃縮された花粉粒は除去され、分析には含まれなかった。 すべての花粉粒を光学顕微鏡で計数した。

花粉コレクションの純度

私たちは、自然集団でA.napellusを訪問マルハナバチから花粉負荷をサンプリングしました。 実験室では、花粉の負荷をアセチル化しました。 少なくとも400 25花粉負荷のそれぞれのランダムに選択された花粉粒を同定し、光学顕微鏡下でカウントされました。

昆虫訪問者の味覚応答

我々は、Maらのプロトコルに従った。Aconitineの検出のための54。 捕獲されたとき、個々のミツバチは、室温で、実験室で完全な暗闇の中でプラスチック製のバイアル（長さ7cm、内径2.8cm）で3時間飢えていた。 私達は把握管、先端であく4mmの穴が付いている15mL遠心分離機管および中固定される鋼鉄網の部分に各蜂を移しました。 スクロースの液滴を用いた試験前段階の後、我々は100μ lのガラスキャピラリーチューブに試験溶液を提示し、管の先端に溶液を維持するために管を静かに圧 5分後に口吻延長のない昆虫を試験から除去した。 試験段階は２分間の長さであり、試験前後の溶液の体積をカリパスで記録した。

テストは、三つの訪問者種（A.mellifera、B.pascuorum、およびB.terrestris）で行われました。 昆虫種あたり十個体を各溶液で試験した。 スクロース（430μ g mg−1）およびアコニチン（232μ g g−1）濃度は、我々の種で見つかったものに対応した。 脱イオン水単独（対照），純しょ糖溶液，およびしょ糖＋アコニチン溶液の三つの溶液を提示した。

すべてのテストについて、飲酒の選択、消費された溶液の量、および溶液との接触時間から、各被験者について抑止指数を次のように計算しました: ID=1-（ショ糖の選択/ショ糖+アコニチンの選択）×（ショ糖の消費量/ショ糖+アコニチンの消費量）×（ショ糖溶液との接触時間/ショ糖+アコニチン溶液との接触時間）。

統計分析

データの正常性はShapiro–Wilk検定を使用して推定され、leveneの検定を使用して同種分散性が検証されました。 正規性と同尺度性の要件が満たされたとき，分散分析（Ａｎｏｖａｓ）を行った（花の揮発性物質に対する花の相効果）。 それ以外の場合は，二つの条件（花の形態と蜜パラメータに対する花相効果）の比較のためのＷｉｌｃｏｘｏｎ試験と二つ以上の条件（消費量に対する昆虫と溶液効果と味覚実験における溶液との接触時間に対する昆虫と溶液効果，訪問行動に対する昆虫効果）の比較のためのＫｒｕｓｋａｌｌ-Ｗａｌｌｉｓ試験を用いてノンパラメトリック試験を行い，カイ二乗試験を行い，味覚実験における個体の割合を比較した。 ANOVAおよびノンパラメトリック解析の後に、二つ以上の条件を比較したときにマルチペアワイズ比較が続きました。 すべての分析はSAS Enterprise Guide7.1で実施されました。 データは、平均±標準偏差として提示される。