移動相

逆相クロマトグラフィーにおける移動相は、水または緩衝液とメタノール、アセトニトリル、イソプロパノール(IPA)、テトラヒドロフラン(THF)などの極性有機溶媒との混合物である。 溶出強度はこの順序でおおよそ増加する。 アルコールはプロトン供与体であり、アセトニトリルはプロトン受容体である。 アセトニトリル／水混合物は、他の溶媒と水との混合物と比較して低い粘度を有する。 これはより低い背圧で起因する。 IPA/水混合物は最高の粘度を有する。 より低い粘度に起因するより低い背圧のために、より一般的に使用される二つの有機移動相改質剤は、アセトニトリルおよびメタノールである。 また、アセトニトリルは低紫外線での吸収が低く、他の溶媒よりもはるかに少ない。

水は逆相クロマトグラフィーで最も弱い溶離液です。 メタノールまたはアセトニトリルの添加は保持を減少させる。 保持係数の対数は有機溶媒濃度に比例してほぼ減少した。 ほとんどの医薬品の場合のように、分析物が小分子である場合、移動相中のメタノール濃度が約20％増加すると、保持率は約7倍に減少する。 多くの状況において（例えば、方法開発において）、保持因子の対数と移動相における有機改質剤の体積分率との間に線形関係があると仮定される。 しかし、これは正確でも理論的に正当なものでもない良い経験則としてのみ考慮する必要があります。

アセトニトリルの溶媒和特性により、一方の溶媒を他方の溶媒に置き換えると、分析物の溶出順序が変化することがよくあります（図2）。 従って、この技術は方法開発で頻繁に使用されます。 ある改質剤から別の改質剤への変化は、溶媒強度のみの変化（すなわち、単に有機溶媒の濃度を変化させることによって）よりも有意な選択性の変化を THFはまた選択率を徹底的に変えます。 実際には、最大の選択性の変化は、多くの場合、thfといくつかのメタノールまたはアセトニトリルを交換することによ しかし、その不快な臭い、過酸化物の形成および好ましくないUV透明性などのいくつかの理由から、それはあまり頻繁に使用されない。

図2。 分離の選択性に対する移動相修飾剤の影響。 上、アセトニトリル、下、メタノール。 カラム：XTerra RP18、4.6mm×50mm、3.5μ m。 2ml分での勾配−ギ酸アンモニウムを用いたpH3で0から80％の有機15分以上。 分析物:1、トリアムテレン;2、クロルタリドン;3、アルチアジド;4、フロセミド;5、ベンズチアジド;6、プロベネシド;7、エタクリン酸;8、ブメタニド;9、カンレン酸。 （クロマトグラムは、Ｄｉａｎｅ ＤｉｅｈｌおよびＫｉｍ Ｔｒａｎ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから提供される。)

溶媒選択性の解釈は、有機溶媒が固定相リガンドに吸着され、固定相の一部であると考えることができるという事実によっ 最近、いくつかの著者は、標準的なC18型固定相の有機改質剤の表面過剰を測定し、アセトニトリルとメタノールの間の表面溶媒和に有意な差を発見し

メタノールはアセトニトリルよりも高い保持性を提供することは、このセクションの冒頭で言及された。 これは、非イオン化化合物よりもイオン化化合物の方がさらに顕著である。 これは，定常相中に吸着したメタノールが定常相へのイオン化分子の浸透を容易にするという観点から理にかなっている。 メタノールをＴＨＦと比較すると同じパターンが見られた。 これらは、メソッドの開発に便利な機能です。 一方、スルホンアミド官能基を有する化合物は、参照分析物のグループと比較して、THF中で比較的多くの保持を示す。 全体として、分離の選択性に対する有機溶媒の有意な影響が観察され得るが、溶媒は固定相および移動相の両方で見出すことができるので、合理化は困難である。 一部の著者はまた、含水率の高い移動相と含水率の低い移動相とを区別しようとしている。

上記のように、異なる溶媒間の重要な選択性の違いは、逆相分離の開発において非常に有用なツールである。 古典的な方法開発スキームは、移動相の有機修飾剤としてメタノール、アセトニトリル、およびTHFを使用しています。 中間選択性は、溶媒混合物を用いて得ることができ、ピーク間隔の調整は難なく達成することができる。 現代の方法開発スキームは、選択性の調整において、容易に制御可能な別の変数として温度を使用する。移動相への緩衝剤または酸または塩基添加剤の助けを借りてイオン化性化合物の保持を制御することは非常に重要である。

移動相選択性の重要 移動相のｐＨを慎重に選択することによって、保持および選択性の操作を容易にすることができる。 上述したように、分析物のイオン化形態と非イオン化形態との間の保持の差は、１ ０〜３ ０倍であってもよく、ｐＨ制御は重要である。近年、有機溶媒が添加されると、緩衝液のpHおよびイオン化定数の両方が変化することが研究によって示されている。

これは保持の制御のための重要な結果をもたらす。 移動相のpHが分析物のpKaから±2pH単位離れている場合、通常、分析物の定義されたイオン化に到達することができる。 しかし、pHと分析物pKaの両方が有機溶媒の添加によって変化している場合、これは単純な規則を使用して対処するのは容易ではありません。 したがって，良好なｐ ｈ制御と良好な緩衝液は，イオン化性分析物の逆相分離の再現性の重要な要素である。 PHは水中で測定され、一般的に使用される緩衝液のpKa値に精通しており、これらのpKa値の近くにとどまることを好む。 最大バッファ容量は、バッファのpKaで検出されます。 有機溶媒の存在下でｐＨは変化するが、緩衝液容量は変化しない。 逆相クロマトグラフィーの開業医にとって、これは保持制御の重要な側面です。 一方、逆相保持機構の研究者は、保持への影響を完全に理解するために、有機溶媒の存在下でpHを測定するために準備する必要があります。 典型的には、有機溶媒の添加は、酸のｐＫａの増加をもたらし、塩基のｐｋａの減少をもたらす。 これは、緩衝液および分析物の両方に適用される。 これは、分析物の予想されるイオン化パターンに有意なシフトをもたらす可能性がある。 これを示す例を次に示します: 9のpkaのアミンは水のpH7の隣酸塩緩衝で完全にイオン化されますが、70%のメタノールの付加の後で同じ緩衝で半分だけイオン化されてもよいです。 そのような効果が重要であることは明らかである。 したがって、緩衝液を調製し、そのpHを制御するための正確な方法は、イオン化可能な分析物の逆相保持を良好に制御するために不可欠である。

他のイオン相互作用は、イオン化された分析物の逆相分離の保持および選択性にも影響する。

他のイオン相互作用は、イオン化された分析物の イオン分析物の保持を増加させるための古典的なツールは、イオン対クロマトグラフィーです。 この技術では、固定相は、長鎖スルホン酸イオン（例えば、オクチルスルホン酸）または疎水性四級アミン（例えば、テトラブチルアンモニウムイオン）のような疎水性荷電イオンで平衡化される。 典型的な移動相濃度は約10mMであり、移動相へのイオン対試薬の添加は、ターゲットイオンの保持を増加させ、イオン対試薬と同じ電荷のイオンの保持を減少させ、双性イオンを含む中性分析物の保持をほぼ影響を受けない。 従ってそれは分離の選択率を調節する優秀な用具である。 選択性のこれらの変化の理由は、イオン対試薬が固定相の表面に吸着されるという事実である。 得られた保持機構の最も簡単な解釈は、イオン交換と逆相機構の組み合わせである。 移動相中のイオン対試薬の濃度が増加するにつれて、反対に帯電した分析物の保持は最初に増加し、その後、より高い濃度で水平になる。 異なる鎖長を有するイオン対試薬の場合、保持はより長い鎖長とともにより急速に増加する。

カチオン性分析物で遭遇するもう一つのイオン相互作用効果は、小さな無機対イオンが移動相に添加されるときの保持の増加である。 必要とされる濃度は、典型的には、イオン対試薬で使用される濃度よりも約１ ０倍高い。 このタイプの典型的な陰イオンは過塩素酸塩（Clo4−）、tetrafluoroborate（BF4−）、またはhexafluorophosphate（PF6−）です。 それらはカチオン性分析物の保持を有意に増加させる。 この効果は移動相添加剤としてのアセトニトリルではメタノールよりも顕著であった。 これはメタノールの単分子層と比較して固定相に吸着したアセトニトリルの厚い層と，この層への対イオンの分配によって説明される。 ユーザの観点から，これらの無機アニオンの存在下でのカチオン性分析物の保持挙動は，真のイオン対試薬，すなわち長鎖スルホン酸で観察されたものとは異ならない。