吸収スペクトル

チアミンの吸収スペクトルを水（図1）に対して記録したところ、チアミンは235nmで最大吸収ピーク（λ max）を示すことが分かった。 チアミンの高度にブルーシフトσ maxのために、紫外線に対するその吸収の直接測定に基づく剤形でのその決定は、一般的な賦形剤からの潜在的な干渉 したがって，可視範囲吸収種を達成するためのチアミンの誘導体化は間違いなく必要であった。 そこで、NBD-Clによるチアミンの誘導体化を行い、生成物の吸収スペクトルを試薬ブランクに対して記録しました(図1)。 生成物は434nmでλ maxを示す茶色であり、NBD-Clのλ maxは342nmであることが分かった。 チアミン-ＮＢＤ-Ｃ ｌ誘導体のσ ｍａｘは赤シフトし，潜在的な干渉を排除した。 したがって、波長434nmを最適として固定した。

反応条件の最適化

図1：チアミン（3）、NBD-Cl（2）とそれらの間の複合体（1）の吸収スペクトル。

開発した方法の最適条件は、他のパラメータを一定に保ちながらパラメータを一つずつ変化させ、着色生成物の吸光度に及ぼす影響に従うことによ 実験条件を確立するために，ｐｈ，時間，緩衝液量およびＮＢＤ-Ｃ ｌの濃度などの種々のパラメータの効果を調べた。

pHの効果

チアミンとNBD-Clとの間の反応に対するpHの効果は、pH形態を7.0から12.0に変化させることによって試験した。 図2に示すように、生成物の吸光度はpH7.0で低く、中性媒体中ではチアミン（NBD-Cl）と反応できないことを示しています。 これは求核置換能力を阻害する塩酸塩の形態のチアミンのアミノ基の存在によるものと考えられた。 PHが7から12に増加すると、測定値は劇的に増加し、チアミンのアミノ基を放出し、求核置換を容易にする。 最大吸収は10.5のpH値で達成された。 PH値が10.5以上では、吸収の減少が起こった。 これはおそらくチアミンとＮＢＤ-Ｃ ｌとの後方反応速度を増加させる水酸化物イオンの量の増加に起因すると考えられた。

反応時間の影響

反応生成物の吸光度を異なる時間でモニターした（図3）。 結果は、チアミンが25℃でNBD-Clと反応し、吸光度が徐々に増加し、25分後に最大に達し始めることを示しています。 より長い反応時間のために、吸光度のわずかな低下が観察された。 したがって、決定のための便利な反応時間として25分を設定した。

バッファの量の影響

図2：チアミンとNBD-Clの反応に及ぼすpHの影響。チアミン（20μ g/ml）：1ml、NBD-Cl conc。 0.2％（w/v）、反応時間20分。

図3：チアミンとNBD-Clとの反応に及ぼす反応時間の影響。 チアミン（20μ g/ml）：1ml、緩衝液（pH10。5）：1.5ml、NBD-Cl conc。 0.2%（w/v）。

pHを10.5に保つと、反応生成物の吸光度に及ぼす緩衝液の量の影響も研究されました（図4）。 図は、反応生成物の吸光度は、緩衝液の量の上昇とともに急速に増加し、緩衝液の量が1.5mLに達すると最大になることを明らかにする。 したがって、1.5mLの緩衝液の量は、最高の吸光度を確保するために選択された。

NBD-Cl濃度の効果

NBD-Cl濃度の効果の研究は、反応が試薬濃度に依存していることを示した。 最高の吸収強度は0.2％（w/v）のNBD-Cl濃度で達成され、NBD-Clの濃度が高いほど吸光度が低下する（図5）。

上記のパラメータ調整実験から、アッセイに使用される最適化された条件は、pH10.5、NBD-Cl濃度0.2％（w/v）、緩衝液の体積1.5mL、反応時間25分および温度25℃であった。図4：チアミンとNBD-Clの反応に対する緩衝液量（ml）の影響。チアミン（20μ g/ml）：1ml、緩衝液pH：10.5、NBD-Cl conc。 0.2％（w/v）、反応時間25分。

図5：チアミンとの反応に及ぼすNBD-Cl濃度の影響。チアミン（20μ g/ml）：1ml、緩衝液（pH10.5）：1.5ml、反応時間25分。

メソッドの検証

メソッドは、次のパラメータに対して検証されました: 国際調和会議（ICH）ガイドラインに従って、特異性、直線性、精度、精度、検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）、およびロバスト性。

直線性、検出限界（LOD）定量限界（LOQ）

直線性は、05–35μ g/mLの範囲でチアミンの七濃度を構築することによって決定された線形回帰分析によって評価され、最小二乗回帰法によって計算され、較正式および相関係数を計算した。 検量線は、線形回帰分析を用いて、濃度対吸光度をプロットすることによって構築された。 結果の回帰式は、A=0.033x-0.009(r2=0.999)であり、ここで、Aは434nmでの吸光度であり、xは05-35μ g/mLの範囲のチアミンのμ g/mL中の濃度であり、rは相関係数である(表1)。 線形濃度範囲はＮＱＳを用いた以前の方法と同等であることが分かった。 検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）は、以下の式ＬＯＤ＝３に従って決定した。3×SDa/b、LOQ=10×SDa/b、SDaは切片の標準偏差、bはICHガイドライン下の傾きです。 LODおよびLOQは、それぞれ0.667μ g/mLおよび2.020μ g/mLであることが見出された（表1）。

波長(nm)

パラメータ	値
測定値
測定値
測定値
測定値
測定値
測定値
測定値
線形範囲(μ g/ml)
回帰式	y=0.033x-0。009
Intercept
Standard deviation of intercept
Slope
Standard deviation of slope
Correlation coefficient (r2)
Limit of detection, LOD (μg/mL)
Limit of quant., LOQ (μg/mL)

Table 1: Parameters for the performance of the proposed method.

精度

提案された方法の精度は、サンプルから回収された薬物の割合として計算された線形範囲内の3つの異なる濃度10、20、および30μ g/mLのチアミン薬物を適用することによって行われた（表2）。

Sample No	Sample Content (µg/mL)	Thiamine Standard Amount (µg/mL)	Amount Found (Total) (µg/ml)	Recovery + SD*
				96.29+0.015
				98.90+0.018
				101.47+0.148

Table 2: 提案した方法によるチアミンの定量のための回収研究。
*値は三つの決定の平均です。

相対誤差（RE）は0.24％以内であり、対応する標準偏差は3つの異なる決定に対して0.004以内であった（表3）。

Sample No

Concentration (μg/mL)

Concentration Found (μg/mL)

Recovery (% + SD)

Relative Error (%)

95.5±0.004

96.46±0.Td>

表3:精度と精度の評価。

ロバスト性

反応機構：NBD-Clは、一次または二次アミン誘導体のアミノ基と反応することが報告されている。 同様に、チアミンのアミノ基は、窒素原子上の孤立電子対のために求核剤として作用し、NBD–Clの電子欠損中心を攻撃する傾向がある（表4&図6）。 同時に、生成物の組成はチアミンとNBD-Clの1：1であることが証明されている（図7）。 チアミンのアミノ基はＮＢＤ-Ｃｌと反応して褐色付加体を形成すると結論した。 反応式を図7に示します。P>

図6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

Parameter	Recovery (% ± SD)
Recommended condition	97.50±0.003
NBD-Cl concentration (0.22%)	98.75±0.002
NBD-Cl concentration (0.180%)	96.0.002
緩衝液PH（10.3）
緩衝液PH（10.3）
緩衝液PH（10.3）
緩衝液PH（10.3）
緩衝液PH（10.3）
緩衝液PH（10.3）
緩衝液PH（10.3）	緩衝液PH（10.3）	緩衝液PH（10.3）	緩衝液PH（10.3）
反応時間min(23)	反応時間min(27)	反応時間min(27)	反応時間min(27)	反応時間min(27)	反応時間min(27)

表4：nbd-cl試薬を用いたチアミンの定量のための提案された分光光度法の分析性能に及ぼすアッセイ条件の小さな変動の影響。

チアミン剤形の分析への提案された方法の適用

チアミン錠剤は、提案された分析に供され、ラベル請求は表5に示すように、私たちの新しい方 提案した方法は賦形剤による干渉から事実上自由であるという利点を有する。

Brand Name of Label Claim (Mg)	Amount Found (Mg)	(% Found ± SD)a
Thiamine tablets (100 mg)		99.9±0.025

Table 5: Analysis of Thiamine-containing dosage form by the proposed method.
a: values are mean of five determinations.

Figure 7: チアミンとNBD-Clとの反応は1:1の化学量論を示す。 p>