GDF11PRO-Fc se lie à la fois à GDF11 et à MSTN

Pour montrer que GDF11PRO-Fc Fc peut séquestrer le dimère actif de GDF11 mature via une interaction directe, nous avons cherché à identifier une interaction protéine-protéine entre GDF11 et GDF11PRO-Fc. De plus, en raison de l’homologie structurelle étroite des dimères matures GDF11 et MSTN, nous voulions également déterminer si GDF11PRO-Fc était associé au MSTN. Pour identifier ces interactions protéine-protéine, nous avons effectué un ensemble de tests déroulants (Fig. 1). Les ligands rGDF11, rMSTN et Ractivine A ont été incubés avec des fractions de lysat de cellules HEK293 transfectées avec un plasmide codant pour GDF11PRO-Fc ou MPRO-Fc à pH 7,4. Grâce aux fragments Fc conjugués sur les propeptides modifiés, des fractions ont pu être abaissées directement sur une résine d’agarose protéine A/G. Comme prévu, GDF11PRO-Fc a effectivement abattu rGDF11 et rMSTN, indiquant que GDF11PRO-Fc était capable de lier les deux ligands. De plus, MPRO-Fc a également réussi à abattre rGDF11 et rMSTN. GDF11PRO-Fc et MPRO-Fc n’ont pas été en mesure d’abaisser le ligand de superfamille TGF-β plus éloigné, la ractivine A, ce qui indique que la liaison au ligand est spécifique (Fig. 1). Aucune liaison de GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN ou Ractivine A n’a été observée sur une résine d’agarose témoin sans protéine A/G. À partir de ces résultats, nous concluons que GDF11PRO-Fc s’associe spontanément aux dimères matures de GDF11 et de MSTN à pH physiologique.

GDF11PRO-Fc s’associe à GDF11 et MSTN. Les interactions protéine-protéine entre GDF11PRO-Fc ou MPRO-Fc et rGDF11, rMSTN ou Ractivine A ont été déterminées par un test de traction vers le bas. GDF11PRO-Fc ou MPRO-Fc a été incubé avec rGDF11, rMSTN ou Ractivine A pendant 1 h à 4 °C. Des complexes protéiques fusionnés au Fc ont été séparés sur une résine d’agarose enrobée de protéine A/G et des éluats ont été exécutés sur un gel SDS-PAGE à 12% dans des conditions réductrices et sondés par western blot. Le contrôle des entrées représentait 5% de la matière d’entrée. WB western blot

GDF11PRO-Fc bloque l’atrophie induite par GDF11/MSTN dans les myotubes en C2C12

Il a déjà été démontré que l’addition de rGDF11 et de rMSTN à des myotubes différenciés induisait une atrophie chez le C2C12 murin et le squelette humain primaire myotubes. Après avoir déterminé que GDF11PRO-Fc lie GDF11 et MSTN, nous avons ensuite demandé si GDF11PRO-Fc pouvait prévenir l’atrophie des myotubes induite par GDF11 / MSTN dans les myotubes différenciés en C2C12. Pour ce faire, nous avons empaqueté la séquence d’ADN codant pour GDF11PRO-Fc dans la capside AAV6 pour générer le vecteur AAV6-GDF11PRO-Fc. Dans ces expériences, le vecteur AAV6 a été sélectionné pour sa capacité à transduire efficacement et sélectivement des myotubes différenciés en C2C12, mais pas des myoblastes. Les myoblastes en C2C12 ont été cultivés et différenciés pendant 5 jours avant le traitement par AAV6-GDF11PRO-Fc ou AAV6-EGFP (vecteur témoin) à un MOI de 105 (Fig. 2 bis). Comme prévu, l’expression de la GFP était observable chez les myotubes en C2C12 infectés par l’AAV6-EGFP 48-72 h après l’infection, et la quantification des copies du génome vectoriel internalisées par génome diploïde 72 h après l’infection a indiqué que la transduction vectorielle était correctement réalisée (Fig. 2b et c).

GDF11PRO-Fc bloque l’atrophie myotube induite par GDF11/MSTN dans les cellules C2C12. un schéma détaillant la chronologie expérimentale dans les myotubes C2C12. AAV6-EGFP ou AAV6-GDF11PRO-Fc a été ajouté aux myotubes C2C12 à un MOI de 105 le jour 5 après différenciation et 100 ng / ml rGDF11 ou rMSTN a été ajouté le jour 7. Les myotubes ont été tachés et analysés le jour 10. l’expression de b EGFP était évidente à 48-72 h dans les myotubes en C2C12 traités avec AAV6-EGFP (MOI 10). Les barres d’échelle représentent 50 µm. nombre de copies du génome du vecteur c par génome diploïde dans les myotubes C2C12 72 h après addition d’AAV6-EGFP ou d’AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10). d Images d’immunofluorescence représentatives des myotubes en C2C12. Les membranes du myotube C2C12 ont été visualisées par coloration avec un anticorps anti-dystrophine (rouge). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). L’encart montre une région agrandie. Les barres d’échelle représentent 50 µm (panneau principal) et 25 µm (encart de panneau). e La fraction de noyaux incorporés dans les myotubes (indice de différenciation) a été calculée et présentée en pourcentage du contrôle. f Diamètre moyen du myotube par rapport au contrôle et (g) distribution des mesures de diamètre. Pour les mesures du diamètre du myotube, chaque myotube a été mesuré en trois points de la longueur du myotube et moyenné. h Nombre de noyaux incorporés par myotube. Un minimum de 50 myotubes ont été analysés par condition expérimentale. i pSMAD2/3 par rapport à tSMAD2/3 a été évalué par western blot. Une charge protéique égale a été vérifiée par coloration Ponceau S et le GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. Les données représentent les résultats de trois expériences distinctes. Toutes les barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Soixante-douze heures plus tard, les myotubes ont été fixés et colorés pour une analyse d’immunofluorescence en utilisant un anticorps reconnaissant la dystrophine (tige 22 / tige 23) pour visualiser les membranes périphériques des myotubes et le DAPI pour colorer les myonucléi (Fig. 2d). Une réduction de l’indice de différenciation, qui est défini comme la proportion de myonucléi incorporés dans les myotubes, a été observée chez les myotubes traités par rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) ou rMSTN (−14%, p = 0,0013) par rapport au témoin non traité. Cependant, cet effet a été atténué dans les myotubes C2C12 exprimant GDF11PRO-Fc traités avec rGDF11 (- 1,9%; p = 0.0047, par rapport au témoin traité rGDF11) ou rMSTN (- 3,0%; p = 0,0040, par rapport au témoin traité rMSTN; Fig. 2e). De plus, les myotubes C2C12 traités par AAV6-GDF11PRO-Fc ont résisté à l’atrophie des myotubes induite par le rGDF11 ou le rMSTN. Une diminution substantielle du diamètre moyen des myotubes par rapport au témoin a été détectée chez les myotubes traités avec rGDF11 (− 39 % ; 0,0002) ou rMSTN (− 35 %; p = 0,0003) par rapport au témoin. Au contraire, les myotubes exprimant GDF11PRO-Fc traités par rGDF11 (− 1,8%; p = 0,0005, par rapport au témoin traité par rGDF11) ou rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, par rapport aux témoins traités par rMSTN) n’ont pas été affectés (Fig. 2f et g). Dans une expérience distincte, GDF11PRO-Fc n’a pas pu prévenir l’atrophie myotube induite par la ractivine A, ce qui est conforme à l’observation selon laquelle GDF11PRO-Fc ne lie pas l’activine A (fichier supplémentaire 1: Figure S3).

Le traitement par rGDF11 ou rMSTN a également été associé à une proportion plus faible de myotubes matures avec un nombre plus élevé de myonucléi, ce qui suggère une inhibition de la différenciation des myotubes. Les myotubes avec plus de 11 myonucléi ne représentaient que 5,2 % (p = 0,0215) et 7,2 % (p = 0.0328) de myotubes analysés dans des cellules traitées avec rGDF11 et rMSTN, respectivement. En comparaison, les myotubes de plus de 11 noyaux constituaient 26% des myotubes analysés dans les myotubes témoins. Dans les myotubes exprimant GDF11PRO-Fc traités par rGDF11 ou rMSTN, la proportion de myotubes présentant plus de 11 myonucléi était respectivement de 22% (p = 0,0104 par rapport au témoin traité par rGDF11) et de 19% (p = 0,0404 par rapport au témoin traité par rMSTN) (Fig. 2h). Enfin, en accord avec ce qui serait attendu après la signalisation GDF11/MSTN à ActRII, une augmentation des taux de protéines SMAD2/3 phosphorylées (pSMAD2/3) dans les myotubes traités par AAV6-EGFP et rGDF11 ou rMSTN a été observable sur western blot 24 h après addition du ligand (Fig. 2i). Cette augmentation des taux de pSMAD2/3 était absente chez les myotubes traités avec AAV6-GDF11PRO-Fc, suggérant que l’expression de GDF11PRO-Fc antagonise l’activation induite par GDF11/MSTN de SMAD2/3 dans les myotubes différenciés. Globalement, ces résultats indiquent que GDF11PRO-Fc a pu prévenir l’atrophie des myotubes induite par rGDF11 et rMSTN et l’inhibition de la différenciation dans les cellules C2C12.

L’expression localisée de GDF11PRO-Fc induit une hypertrophie du muscle squelettique chez les souris adultes

Auparavant, nous avons démontré que la livraison systémique de gène à médiation vectorielle AAV de GDF11PRO-Fc chez les souris néonatales a conduit à une augmentation significative du taux de croissance du muscle squelettique. Cependant, il n’était pas clair d’après cette étude si GDF11PRO-Fc augmentait ou non simplement la croissance du muscle squelettique ou induisait réellement une hypertrophie du muscle squelettique. De plus, il n’a pas été possible de déterminer si les effets de GDF11PRO-Fc étaient médiés par un blocage local de GDF11 / MSTN dans le muscle squelettique ou si les effets observés étaient dus à une modulation systémique de GDF11 / MSTN. Pour répondre à ces questions, nous avons évalué l’impact de l’administration intramusculaire d’AAV9-GDF11PRO-Fc chez des souris C57BL/6J adultes. Dans ces études, seul le membre postérieur droit a été injecté et le membre postérieur controlatéral gauche a été utilisé comme témoin.

Le poids corporel a légèrement augmenté avec le temps chez les souris traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc (+10 % à 10 semaines; p = 0,0418; Fig. 3 bis). De plus, la force de préhension d’un seul membre postérieur normalisée au poids corporel a été significativement augmentée dans les deux membres testés individuellement, avec l’effet plus important observé chez le membre postérieur droit traité (+37%; p = 0,0177), bien qu’une augmentation significative de la force de préhension normalisée chez le membre postérieur gauche non traité (+18 %; p = 0,0426) ait également été observée. Cependant, cette différence n’a pas atteint sa signification lorsque les deux membres postérieurs ont été testés simultanément (+15%; p = 0,2375; Fig. 3b). Dix semaines après l’administration du vecteur, le membre postérieur droit était visiblement plus gros chez les souris traitées avec AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). Chez les souris traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc, la masse tissulaire humide du tibial antérieur droit injecté (+50%; p = 0,0046) et du gastrocnémien (+37%; p = 0,0023) était significativement plus élevée que chez les témoins traités par véhicule. Il n’y avait pas de différence statistiquement significative dans la masse tissulaire humide des muscles postérieurs du côté gauche non traités (Fig. 3d). L’analyse de la surface des myofibres a révélé une augmentation de la surface de section moyenne des myofibres (+15%; p = 0.0078) dans le gastrocnémien droit injecté par AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3e et f). L’analyse de la distribution de la MFD a également révélé un déplacement vers des myofibres plus grands dans le gastrocnémien droit des souris injectées avec AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3g), indiquant que l’expression localisée de GDF11PRO-Fc induisait une hypertrophie musculaire. Dans une cohorte distincte, nous avons également évalué l’impact de l’administration localisée du gène GDF11 par une injection intramusculaire d’AAV9-GDF11 dans le membre postérieur droit, et une atrophie musculaire significative a été observée 10 semaines après le traitement dans le membre postérieur injecté (fichier supplémentaire 1: Figure S4).

GDF11PRO-Fc induit une hypertrophie localisée du muscle squelettique après la livraison intramusculaire du gène. des souris C57BL/6J âgées de 8 semaines ont été traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc (n= 5) ou véhicule (n= 5) par injection intramusculaire unilatérale dans le membre postérieur droit. Le membre postérieur controlatéral gauche n’a pas été traité. Les souris ont été euthanasiées 10 semaines après le traitement. un poids corporel moyen au fil du temps. b Force de préhension des membres postérieurs normalisée au poids corporel 10 semaines après le traitement. Les mesures sont présentées à partir d’un seul membre postérieur et des deux membres postérieurs. c Musculature grossière représentative des membres postérieurs. Le membre postérieur injecté est désigné par une flèche noire. d Poids des tissus humides du tibial antérieur et du gastrocnémien. e Des images d’immunofluorescence représentatives de coupes transversales du gastrocnémien du côté droit injectées colorées avec de la WGA conjuguée à l’AlexaFluor-488 pour visualiser les myofibres. Les barres d’échelle représentent 100 µm. f Surface moyenne de la section transversale des myofibres dans le gastrocnémien droit injecté. g Distribution de la MFD de myofibres dans le gastrocnémien du côté droit injecté. Un minimum de 500 myofibres ont été mesurés par souris. h Western blot identification of GDF11PRO-Fc in tissue lysats from injected right-side gastrocnemius and liver samples of treated mice. Le GDF11PRO-Fc n’était pas détectable chez les souris traitées par véhicule. Une charge protéique égale a été vérifiée par coloration Ponceau S et le GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. Toutes les barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM. * p < 0,05; **p < 0,01; n.s. non significatif; par rapport au témoin traité sur le véhicule. TA tibialis anterior, gastrocnémien gazeux

L’analyse par Western blot a indiqué que la protéine GDF11PRO-Fc était exprimée dans le gastrocnémien du côté droit injecté par AAV9-GDF11PRO-Fc (bande de 58 kDa; Fig. 3h). Cependant, GDF11PRO-Fc n’était pas détectable dans le gastrocnémien gauche non traité à la même quantité totale de protéines chargée, ce qui suggère que la majorité de l’expression de GDF11PRO-Fc du muscle squelettique était localisée au membre postérieur droit injecté (données non montrées). Le GDF11PRO-Fc était également détectable dans le foie par western blot, ce qui indique qu’une certaine exposition systémique s’était produite (Fig. 3h). Cette observation peut très probablement être attribuée à une fuite vasculaire du vecteur AAV9 dans la circulation systémique à partir du site d’injection. À partir de ces données, nous déterminons que GDF11PRO-Fc induit une hypertrophie des muscles squelettiques chez les souris adultes. De plus, ces effets sont au moins partiellement médiés par le blocage local de GDF11 / MSTN sur le muscle squelettique, probablement via l’inhibition des interactions du ligand avec ActRII sur le tissu musculaire squelettique.

La livraison systémique du gène GDF11PRO-Fc augmente la masse et la force des muscles squelettiques chez les souris mdx

Ensuite, nous avons évalué l’impact de l’expression systémique de GDF11PRO-Fc chez les souris mdx afin de déterminer si GDF11PRO-Fc pouvait également induire une hypertrophie et augmenter la force du muscle squelettique dystrophique. Pour les besoins de cet essai, la construction GDF11PRO-Fc a été modifiée avec une mutation pour la rendre imperméable au clivage endogène de la métalloprotéinase de type BMP1 / TLD (GDF11PRO-Fc D122A) et augmenter la persistance des facteurs dans la circulation systémique. Pour ces expériences, AAV9-GDF11PRO-Fc et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A ont été évalués pour établir si le transgène D122A muté conduirait à un effet plus prononcé in vivo. Pour obtenir une expression systémique, les souris mdx ont été traitées avec un vecteur ou un véhicule par injection de veine de queue. Après l’administration intraveineuse, le vecteur AAV9 transduit le foie de souris avec une grande efficacité. Les hépatocytes transduits peuvent alors exprimer le transgène et sécréter le produit protéique dans la circulation systémique.

À partir de 3 semaines après l’injection, nous avons observé une augmentation significative du poids corporel qui a persisté pendant toute la durée de l’essai avec AAV9-GDF11PRO-Fc (+7,7% à 12 semaines; p = 0,0094) et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+11% à 12 semaines; p = 0,006) traitement (Fig. 4 bis). Il est à noter qu’en raison de la pathologie dystrophique, les souris mdx présentent typiquement une hypertrophie musculaire compensatoire, ce qui peut masquer partiellement l’augmentation de la masse musculaire induite par l’expression de GDF11PRO-Fc. En ce qui concerne les tests de la fonction musculaire, les souris traitées ont montré une force de préhension accrue des membres antérieurs, même après la normalisation du poids corporel. Cependant, la différence de force de préhension normalisée des membres antérieurs n’a atteint une signification statistique que dans le groupe AAV9-GDF11PRO-Fc D122A. 12 semaines après le traitement, la force de préhension normalisée moyenne des membres antérieurs a été augmentée de +28 % (p = 0,0873) et de +36 % (p = 0,0248) chez les souris traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivement (Fig. 4b). Les performances des rotarodes ont également été améliorées par le traitement AAV9-GDF11PRO-Fc D122A en moyenne (augmentation de +93% du temps de latence des rotarodes; p = 0,0127). Les performances des rotarodes ont également été améliorées dans le groupe AAV9-GDF11PRO-Fc, mais cette différence n’a pas atteint de signification statistique (augmentation de +44% du temps de latence des rotarodes; p = 0,2835; Fig. 4c). Aucune différence n’a été observée dans le temps de fonctionnement du tapis roulant entre les groupes (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc améliore la force de préhension et les performances des rotarodes chez les souris mdx dystrophiques. des souris mdx âgées de 6 semaines ont été traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) ou véhicule (n= 7) par injection de veine de queue. un poids corporel moyen au fil du temps. b Force de préhension des membres antérieurs normalisée au poids corporel au fil du temps. c Meilleur temps de chute du rotarode enregistré avant le traitement (ligne de base) et 12 semaines après le traitement. Le meilleur temps de trois tentatives a été utilisé pour l’analyse. d Distance totale parcourue sur un test d’endurance sur tapis roulant à partir du prétraitement (ligne de base) et 12 semaines après le traitement. Toutes les barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. non significatif; par rapport au témoin traité sur le véhicule

À la fin de la 12- essai d’une semaine, l’hypertrophie musculaire était manifestement évidente chez les souris traitées (Fig. 5 bis). Les masses tissulaires humides moyennes du tibial antérieur, du gastrocnémien et du quadriceps ont été augmentées de +17% (p = 0,0472), de + 20 % (p = 0,0011) et de +14 % (p = 0.0333), respectivement, dans le groupe AAV9-GDF11PRO-Fc. Dans le groupe AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, ces valeurs ont encore été augmentées à + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) et + 23% (p = 0,0009) par rapport au contrôle traité par véhicule pour la variation de la masse antérieure moyenne du tibial, de la masse du gastrocnémien et de la masse du quadriceps, respectivement. De plus, la masse de tissu humide du diaphragme a été augmentée de + 19% (p = 0,0162) et de + 26% (p = 0,0014) dans les groupes AAV9-GDF11PRO-Fc et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivement. Fait intéressant, la masse cardiaque n’a pas été modifiée de manière significative par le traitement. La section transversale moyenne des myofibres gastrocnémiennes était plus élevée chez les souris traitées avec AAV9-GDF11PRO-Fc (+23 %; p = 0,0226) et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+25%; p = 0,0170; Fig. 5c et d). Dans l’analyse de la distribution de la MFD, la MFD avait tendance à culminer autour de 20-30 µm dans tous les groupes, ce qui est probablement dû à la proportion plus élevée de petites myofibres régénératrices dans le muscle dystrophique. Cependant, le traitement par AAV9-GDF11PRO-Fc et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A a entraîné une augmentation de la proportion de myofibres avec des MFD supérieurs à 64 µm, suggérant que l’expression du facteur avait induit une hypertrophie des myofibres (Fig. 5e) dans le muscle squelettique.

GDF11PRO-Fc induit une hypertrophie des muscles squelettiques chez les souris mdx dystrophiques. des souris mdx âgées de 6 semaines ont été traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) ou véhicule (n= 7) par injection de veine de queue. Les souris ont été euthanasiées 12 semaines après le traitement. une musculature grossière représentative des membres postérieurs. b Poids des tissus humides des muscles des membres, du diaphragme et du cœur. c Des images d’immunofluorescence représentatives de coupes transversales du gastrocnémien colorées avec de la WGA conjuguée à l’AlexaFluor-488 pour visualiser les myofibres. Les barres d’échelle représentent 100 µm. d Surface transversale moyenne des myofibres dans le gastrocnémien. e Distribution de MFD de myofibres dans le gastrocnémien. Un minimum de 500 myofibres ont été mesurés par souris. f Identification de GDF11PRO-Fc par western blot dans le lysat de tissu hépatique et le sérum de souris traitées avec AAV9-GDF11PRO-Fc. Une charge protéique égale a été vérifiée par coloration Ponceau S et la GAPDH a été utilisée comme contrôle de charge dans les lysats du tissu hépatique. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; n.s. non significatif; par rapport au contrôle traité par véhicule

L’analyse par Western blot a confirmé l’expression protéique des transgènes dans le foie et le sérum. Comme prévu, la bande à 58 kDa correspondent à GDF11PRO-Fc pleine longueur ou GDF11PRO-Fc D122A a été détectable chez les souris traitées. Les taux sériques du propeptide intégral étaient légèrement plus élevés chez les souris traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc D122A que chez celles traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc, suggérant que la persistance sérique du propeptide actif était augmentée par la mutation D122A (Fig. 5f).

Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que l’expression systémique de GDF11PRO-Fc et GDF11PRO-Fc D122A augmente la masse musculaire squelettique chez les souris mdx dystrophiques et que cette hypertrophie musculaire squelettique est associée à des améliorations de la force de préhension et de la coordination motrice. Cependant, le traitement ne semblait pas affecter l’endurance musculaire en fonction des performances de course sur tapis roulant. De plus, le mutant D122A semblait être légèrement plus efficace pour augmenter la masse musculaire et la fonction, probablement en raison de l’amélioration de la persistance sérique.

L’administration systémique du gène GDF11PRO-Fc ne réduit pas la pathologie dystrophique chez les souris mdx

Un certain nombre d’études ont rapporté que le blocage de la signalisation TGF-β-ActRII-SMAD2 /3, que ce soit par inhibition du MSTN ou blocage d’ActRII, peut avoir un avantage thérapeutique dans les modèles animaux de DMD. Pour déterminer l’impact du traitement AAV9-GDF11PRO-Fc sur la pathologie dystrophique, nous avons effectué une analyse histologique des muscles des membres et du diaphragme.

Les signes caractéristiques de la pathologie dystrophique, y compris la nécrose musculaire, la nucléation centrale, le dépôt de collagène intramusculaire et la présence d’infiltrats inflammatoires étaient évidents dans tous les groupes mdx (Fig. 6 bis). Dans le gastrocnémien, le pourcentage de surface fibrotique a été réduit de − 39% (p = 0,0273) chez les souris traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc. La fibrose dans le gastrocnémien a également légèrement diminué dans le groupe AAV9-GDF11PRO-Fc D122A; cependant, en raison de la forte variabilité intersubjective de la fibrose intramusculaire des muscles des membres, cette différence n’a pas atteint de signification statistique (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). Il n’y avait pas non plus de différence significative observée dans la proportion de myofibres à noyau central, ce qui suggère que la régénération des myofibres se produisait activement dans tous les groupes (Fig. 6c). La CK sérique, un marqueur de la dégradation musculaire, n’a pas non plus été modifiée de manière significative par le traitement (Fig. 6d). De plus, une détérioration localisée de l’intégrité de la membrane des myofibres, mesurée par la coloration par immunofluorescence des IgG anti-souris, était évidente dans tous les groupes mdx. De manière inattendue, les souris mdx traitées avec AAV9-GDF11PRO-Fc D122A ont montré une légère augmentation de la zone IgG positive en moyenne, mais cette différence n’a pas atteint de signification statistique (+55%; p = 0,1729; Fig. 6e et f; Fichier supplémentaire 1: Figure S5). Les signes évidents de nécrose des myofibres, de régénération, de nucléation centrale et de pénétrance des IgG n’étaient pas apparents chez le gastrocnémien sauvage de type C57BL/10J, indiquant que ces marqueurs sont spécifiques à la pathologie dystrophique (Fig. 6a-f; Fichier supplémentaire 1: Figure S5).

GDF11PRO-Fc n’atténue pas la pathologie dystrophique chez les souris mdx. des souris mdx âgées de 6 semaines ont été traitées par AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) ou véhicule (n= 7) par injection de veine de queue. Des souris C57BL/10J appariées à l’âge (n = 5) ont également été incluses comme témoins de type sauvage. Les souris ont été euthanasiées 12 semaines après le traitement. un représentant de la coloration HE et MTC à partir de coupes transversales gastrocnémiennes de souris C57BL / 10J et mdx. La nucléation centrale est évidente dans tous les groupes mdx. Les zones localisées de nécrose et de régénération des myofibres sont marquées d’une flèche noire. La zone fibrotique est représentée par la région bleue sur la coloration MTC. Les barres d’échelle représentent 50 µm dans les sections HE et 100 µm dans les sections MTC. b Zone fibrotique dans le gastrocnémien exprimée en pourcentage de la zone transversale totale du muscle. c Pourcentage de myofibres présentant une nucléation centrale. d Mesure des niveaux circulants de CK sérique, un marqueur des lésions musculaires. e Images d’immunofluorescence représentatives de la coloration des IgG de souris (rouge) dans des coupes transversales de tissus gastrocnémiens. La coloration positive des IgG indique une perméabilité des myofibres aux protéines sériques et une perte d’intégrité de la membrane. Des sections ont été co-colorées avec WGA pour visualiser les myofibres individuelles. La zone zoomée est marquée d’une boîte blanche. Les myofibres IgG-positives caractéristiques sont représentées par une flèche blanche. Les barres d’échelle représentent 100 µm. f La surface des myofibres IgG positives exprimée en pourcentage de la surface totale de la section transversale musculaire. g Représentant la coloration HE et MTC des sections transversales du diaphragme de souris C57BL /10J et mdx. Une pathologie étendue est apparente chez les souris mdx mais pas chez les souris C57BL/10J. Les barres d’échelle représentent 100 µm. h Zone fibrotique dans le diaphragme exprimée en pourcentage de la surface de la section transversale totale. *p < 0,05; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; n.s. non significatif; par rapport aux témoins mdx traités par véhicule

Dans le diaphragme, la coloration H&E a révélé une nécrose étendue et un dépôt de collagène intramusculaire dans les groupes mdx traités et non traités (Fig. 6g). Semblable à ce qui a été observé dans le muscle gastrocnémien, le traitement par AAV9-GDF11PRO-Fc ou AAV9-GDF11PRO-Fc D122A a produit une légère réduction de la fibrose intramusculaire du diaphragme dans son ensemble. Le pourcentage moyen de surface fibrotique dans le diaphragme a été réduit de 15% (p = 0,0328) et de 17% (p = 0.019) avec traitement AAV9-GDF11PRO-Fc et AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivement (Fig. 6h). Comme prévu, ces caractéristiques pathologiques étaient largement absentes dans le diaphragme des souris sauvages de type C57BL/10J (Fig. 6g et h). À partir de ces données, nous déterminons que GDF11PRO-Fc et GDF11PRO-Fc D122A sont capables d’inhiber légèrement le dépôt de collagène intramusculaire dans les muscles des membres et le diaphragme sur une période de 3 mois. Cependant, le traitement ne semble pas arrêter le cycle en cours de dégénérescence et de régénération musculaire dans le gastrocnémien ou le diaphragme des souris mdx adultes.