spectrophotomètre à balayage à faisceau unique

Il existe deux grandes classes de dispositifs: faisceau unique et double faisceau. Un spectrophotomètre à double faisceau compare l’intensité lumineuse entre deux trajets lumineux, l’un contenant un échantillon de référence et l’autre l’échantillon d’essai. Un spectrophotomètre à faisceau unique mesure l’intensité lumineuse relative du faisceau avant et après l’insertion d’un échantillon d’essai. Bien que les mesures de comparaison à partir d’instruments à double faisceau soient plus faciles et plus stables, les instruments à faisceau unique peuvent avoir une plage dynamique plus grande et sont optiquement plus simples et plus compacts. De plus, certains instruments spécialisés, tels que les spectrophotomètres construits sur des microscopes ou des télescopes, sont des instruments à faisceau unique en raison de leur praticité.

Historiquement, les spectrophotomètres utilisent un monochromateur contenant un réseau de diffraction pour produire le spectre analytique. Le réseau peut être mobile ou fixe. Si un seul détecteur, tel qu’un tube photomultiplicateur ou une photodiode est utilisé, le réseau peut être balayé pas à pas (spectrophotomètre à balayage) afin que le détecteur puisse mesurer l’intensité lumineuse à chaque longueur d’onde (qui correspondra à chaque « pas »). Des réseaux de détecteurs (spectrophotomètre à réseau), tels que des dispositifs à couplage de charge (CCD) ou des réseaux de photodiodes (PDA) peuvent également être utilisés. Dans de tels systèmes, le réseau est fixe et l’intensité de chaque longueur d’onde de la lumière est mesurée par un détecteur différent dans le réseau. De plus, la plupart des spectrophotomètres modernes dans l’infrarouge moyen utilisent une technique de transformée de Fourier pour acquérir les informations spectrales. Cette technique est appelée spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.

Lors de mesures de transmission, le spectrophotomètre compare quantitativement la fraction de lumière qui traverse une solution de référence et une solution de test, puis compare électroniquement les intensités des deux signaux et calcule le pourcentage de transmission de l’échantillon par rapport à l’étalon de référence. Pour les mesures de réflectance, le spectrophotomètre compare quantitativement la fraction de lumière réfléchie par les échantillons de référence et d’essai. La lumière de la lampe source est passée à travers un monochromateur, qui diffracte la lumière en un « arc-en-ciel » de longueurs d’onde à travers un prisme rotatif et émet des largeurs de bande étroites de ce spectre diffracté à travers une fente mécanique du côté de sortie du monochromateur. Ces largeurs de bande sont transmises à travers l’échantillon de test. Ensuite, la densité de flux de photons (watts par mètre carré généralement) de la lumière transmise ou réfléchie est mesurée à l’aide d’une photodiode, d’un dispositif à couplage de charge ou d’un autre capteur de lumière. La valeur de transmittance ou de réflectance pour chaque longueur d’onde de l’échantillon d’essai est ensuite comparée aux valeurs de transmission ou de réflectance de l’échantillon de référence. La plupart des instruments appliqueront une fonction logarithmique au rapport de transmittance linéaire pour calculer la « capacité d’absorption » de l’échantillon, une valeur proportionnelle à la « concentration » du produit chimique mesuré.

En bref, la séquence d’événements dans un spectrophotomètre à balayage est la suivante:

1. La source lumineuse est brillée dans un monochromateur, diffractée en arc-en-ciel et divisée en deux faisceaux. Il est ensuite scanné à travers l’échantillon et les solutions de référence.
2. Des fractions des longueurs d’onde incidentes sont transmises ou réfléchies par l’échantillon et la référence.
3. La lumière résultante frappe le dispositif photodétecteur, qui compare l’intensité relative des deux faisceaux.
4. Les circuits électroniques convertissent les courants relatifs en pourcentages de transmission linéaires et/ou en valeurs d’absorbance/concentration.

Dans un spectrophotomètre à réseau, la séquence est la suivante:

1. La source lumineuse est brillée dans l’échantillon et focalisée dans une fente
2. La lumière transmise est réfractée en arc-en-ciel avec le réseau de réflexion
3. La lumière résultante frappe le dispositif photodétecteur qui compare l’intensité du faisceau
4. Les circuits électroniques convertissent les courants relatifs en pourcentages de transmission linéaires et/ou en valeurs d’absorbance/concentration

De nombreux spectrophotomètres plus anciens doivent être étalonnés par une procédure appelée « mise à zéro », pour équilibrer la sortie de courant nul des deux faisceaux au niveau du détecteur. La transmission d’une substance de référence est définie comme une valeur de référence (valeur de référence), de sorte que la transmission de toutes les autres substances est enregistrée par rapport à la substance initiale « mise à zéro ». Le spectrophotomètre convertit ensuite le rapport de transmission en « capacité d’absorption », la concentration de composants spécifiques de l’échantillon d’essai par rapport à la substance initiale.

Applications en biochimiedit

La spectrophotométrie est une technique importante utilisée dans de nombreuses expériences biochimiques impliquant l’isolement de l’ADN, de l’ARN et des protéines, la cinétique des enzymes et des analyses biochimiques. Comme les échantillons dans ces applications ne sont pas facilement disponibles en grande quantité, ils sont particulièrement adaptés pour être analysés dans cette technique non destructive. De plus, un échantillon précieux peut être sauvegardé en utilisant une plate-forme de micro-volumes où aussi peu que 1uL d’échantillon est nécessaire pour des analyses complètes. Une brève explication de la procédure de spectrophotométrie comprend la comparaison de la capacité d’absorption d’un échantillon vierge qui ne contient pas de composé coloré à un échantillon qui contient un composé coloré. Cette coloration peut être réalisée soit par un colorant tel que le colorant Bleu Brillant G-250 de Coomasie mesuré à 595 nm, soit par une réaction enzymatique telle qu’on la voit entre la β-galactosidase et l’ONPG (jaunisse l’échantillon) mesurée à 420 nm.: 21-119 Le spectrophotomètre est utilisé pour mesurer des composés colorés dans la région visible de la lumière (entre 350 nm et 800 nm), : 65 il peut donc être utilisé pour trouver plus d’informations sur la substance étudiée. Dans les expériences biochimiques, une propriété chimique et / ou physique est choisie et la procédure utilisée est spécifique à cette propriété afin d’obtenir plus d’informations sur l’échantillon, telles que la quantité, la pureté, l’activité enzymatique, etc. La spectrophotométrie peut être utilisée pour un certain nombre de techniques telles que la détermination de l’absorbance de longueur d’onde optimale des échantillons, la détermination du pH optimal pour l’absorbance des échantillons, la détermination des concentrations d’échantillons inconnus et la détermination du pKa de divers échantillons.:La spectrophotométrie 21-119 est également un processus utile pour la purification des protéines et peut également être utilisée comme méthode pour créer des dosages optiques d’un composé. Les données spectrophotométriques peuvent également être utilisées en conjonction avec l’équation de Beer-Lambert, A =−log 10 T T = cc l = O D {\textstyle A =-\log_{10} T=\epsilon cl=OD}

, afin de déterminer diverses relations entre la transmittance et la concentration, et l’absorbance et la concentration.:21-119 Comme un spectrophotomètre mesure la longueur d’onde d’un composé à travers sa couleur, une substance de liaison au colorant peut être ajoutée afin qu’elle puisse subir un changement de couleur et être mesurée. Il est possible de connaître les concentrations d’un mélange à deux composants en utilisant les spectres d’absorption des solutions étalons de chaque composant. Pour ce faire, il est nécessaire de connaître le coefficient d’extinction de ce mélange à deux longueurs d’onde et les coefficients d’extinction des solutions contenant les poids connus des deux composants. Les spectrophotomètres ont été développés et améliorés au fil des décennies et ont été largement utilisés par les chimistes. De plus, les spectrophotomètres sont spécialisés pour mesurer les valeurs d’absorbance de longueur d’onde de la lumière UV ou visible.: 21-119 Il est considéré comme un instrument très précis qui est également très sensible et donc extrêmement précis, en particulier pour déterminer le changement de couleur. Cette méthode est également pratique pour une utilisation dans des expériences de laboratoire car il s’agit d’un processus peu coûteux et relativement simple.