La Phase mobile

La phase mobile en chromatographie en phase inversée est un mélange d’eau ou de tampon avec un solvant organique polaire tel que le méthanol, l’acétonitrile, l’isopropanol (IPA) ou le tétrahydrofurane (THF). La force d’élution augmente grossièrement dans cet ordre. Les alcools sont des donneurs de protons tandis que l’acétonitrile est un accepteur de protons. Les mélanges acétonitrile / eau ont une viscosité plus faible que les mélanges des autres solvants avec de l’eau. Il en résulte une contre-pression plus faible. Les mélanges IPA / eau ont la viscosité la plus élevée. En raison de la contre-pression plus faible résultant de la viscosité plus faible, les deux modificateurs de phase mobile organiques les plus couramment utilisés sont l’acétonitrile et le méthanol. De plus, l’acétonitrile a une faible absorption dans les faibles UV, beaucoup moins que les autres solvants.

L’eau est l’éluant le plus faible en chromatographie en phase inversée. L’ajout de méthanol ou d’acétonitrile réduit la rétention. Le logarithme du facteur de rétention diminue à peu près proportionnellement à la concentration en solvant organique. Si l’analyte est une petite molécule comme c’est le cas pour la plupart des produits pharmaceutiques, la rétention diminuera à peu près sept fois lorsque la concentration de méthanol dans la phase mobile augmentera d’environ 20%. Dans de nombreuses circonstances (par exemple, dans le développement de méthodes), on suppose qu’il existe une relation linéaire entre le logarithme du facteur de rétention et la fraction volumique du modificateur organique dans la phase mobile. Cependant, il ne faut considérer cela que comme une bonne règle empirique, qui n’est ni exacte ni théoriquement justifiable.

En raison des propriétés de solvatation de l’acétonitrile par rapport au méthanol, le remplacement d’un solvant par l’autre entraîne souvent une modification de l’ordre d’élution des analytes (Figure 2). Par conséquent, cette technique est fréquemment utilisée dans le développement de méthodes. Le changement d’un modificateur à un autre crée des changements de sélectivité plus importants que le changement de la force du solvant seul (c’est-à-dire en modifiant simplement la concentration du solvant organique). Le THF modifie également radicalement la sélectivité. En fait, les changements de sélectivité les plus importants sont souvent causés par le remplacement du méthanol ou de l’acétonitrile par du THF. Cependant, pour plusieurs raisons telles que son odeur désagréable, la formation de peroxydes et une transparence UV défavorable, il n’est pas utilisé très souvent.

Figure 2. Influence du modificateur de phase mobile sur la sélectivité de la séparation. En haut, acétonitrile; en bas, méthanol. Colonne : XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradient à 2 ml min−1 sur 15 min de 0 à 80% organique à pH 3 avec du formiate d’ammonium. Analytes: 1, triamtérène; 2, chlorthalidone; 3, althiazide; 4, furosémide; 5, benzthiazide; 6, probénécide; 7, acide éthacrynique; 8, bumétanide; 9, acide canrénoïque. (Chromatogramme fourni par Diane Diehl et Kim Tran, Waters Corporation.)

L’interprétation de la sélectivité du solvant est compliquée par le fait que le solvant organique est adsorbé par les ligands de phase stationnaire et peut être considéré comme faisant partie de la phase stationnaire. Récemment, plusieurs auteurs ont mesuré l’excès de surface des modificateurs organiques pour les phases stationnaires standard de type C18 et ont trouvé des différences significatives dans la solvatation de surface entre l’acétonitrile et le méthanol.

Il a été mentionné au début de cette section que le méthanol procure une rétention plus élevée que l’acétonitrile. Ceci est encore plus prononcé pour les composés ionisés que pour les composés non ionisés. Ceci est logique du point de vue que le méthanol adsorbé en phase stationnaire facilite la pénétration des molécules ionisées dans la phase stationnaire. Le même schéma se retrouve lorsque le méthanol est comparé au THF. Ce sont des fonctionnalités utiles dans le développement de méthodes. D’autre part, les composés avec des groupes fonctionnels sulfonamides montrent relativement plus de rétention dans le THF, par rapport à un groupe d’analytes de référence. Globalement, on peut observer une influence significative du solvant organique sur la sélectivité d’une séparation, mais une rationalisation est difficile, car le solvant se trouve à la fois en phase stationnaire et en phase mobile. Certains auteurs ont également tenté de distinguer les phases mobiles à forte teneur en eau de celles à faible teneur en eau.

Comme mentionné ci-dessus, les importantes différences de sélectivité entre les différents solvants sont un outil très utile dans le développement de séparations en phase inversée. Les schémas de développement de méthodes classiques ont utilisé le méthanol, l’acétonitrile et le THF comme modificateurs organiques dans la phase mobile. Des sélectivités intermédiaires peuvent être obtenues avec des mélanges de solvants, et un ajustement de l’espacement des pics peut être réalisé sans difficulté. Les schémas de développement de méthodes modernes utilisent la température comme une autre variable facilement contrôlable dans l’ajustement de la sélectivité.

Un aspect important de la sélectivité de la phase mobile est son pH. Le contrôle de la rétention des composés ionisables à l’aide de tampons ou d’additifs acides ou basiques dans la phase mobile est très important. En choisissant judicieusement le pH en phase mobile, on peut faciliter la manipulation de la rétention et de la sélectivité. Comme mentionné ci-dessus, la différence de rétention entre la forme ionisée et la forme non ionisée d’un analyte peut être de 10 à 30 fois, et le contrôle du pH est important.

Ces dernières années, des recherches ont montré que le pH et les constantes d’ionisation du tampon sont altérés, lorsque des solvants organiques y sont ajoutés. Cela a des conséquences importantes pour le contrôle de la rétention. On peut généralement arriver à une ionisation définie de l’analyte si le pH de la phase mobile est à ± 2 unités de pH du pKa de l’analyte. Mais si le pH et l’analyte pKa changent tous deux avec l’ajout de solvant organique, ce n’est pas facile à gérer en utilisant des règles simples. Par conséquent, un bon contrôle du pH et un bon tampon sont des éléments importants de la reproductibilité d’une séparation en phase inversée des analytes ionisables. Le pH est mesuré dans l’eau, où l’on connaît les valeurs de pKa des tampons couramment utilisés, et l’on préfère rester proche de ces valeurs de pKa. La capacité maximale de la mémoire tampon se trouve au pKa de la mémoire tampon. Alors que le pH change en présence du solvant organique, la capacité tampon ne le fait pas. Pour le praticien de la chromatographie en phase inversée, il s’agit d’un aspect important du contrôle de la rétention. D’autre part, l’investigateur des mécanismes de rétention en phase inversée doit être prêt à mesurer le pH en présence du solvant organique pour bien comprendre son influence sur la rétention. Typiquement, l’addition du solvant organique entraîne une augmentation du pKa des acides, et une diminution du pKa pour les bases. Ceci s’applique à la fois aux tampons et aux analytes. Cela peut entraîner un changement significatif du schéma d’ionisation attendu d’un analyte. Voici un exemple qui illustre cela: une amine de pKa 9 est complètement ionisée dans un tampon phosphate à pH 7 dans l’eau, mais elle ne peut être qu’à moitié ionisée dans le même tampon après addition de méthanol à 70%. Il est clair que de tels effets sont significatifs. Par conséquent, une manière précise de préparer un tampon et de contrôler son pH est vitale pour un bon contrôle de la rétention en phase inversée des analytes ionisables.

D’autres interactions ioniques affectent également la rétention et la sélectivité d’une séparation en phase inversée des analytes ionisés. Un outil classique pour augmenter la rétention des analytes ioniques est la chromatographie par paires d’ions. Dans cette technique, la phase stationnaire est équilibrée avec un ion chargé hydrophobe, tel qu’un ion acide sulfonique à longue chaîne (par example l’octylsulfonate) ou une amine quaternaire hydrophobe (par example l’ion tétrabutylammonium). Une concentration typique en phase mobile est d’environ 10 mM. L’ajout du réactif à paires d’ions à la phase mobile augmente la rétention des ions cibles, diminue la rétention des ions de la même charge que le réactif à paires d’ions et laisse la rétention des analytes neutres, y compris les zwitterions, presque inchangée. C’est donc un excellent outil pour ajuster la sélectivité d’une séparation. La raison de ces changements de sélectivité est le fait que le réactif à paires d’ions est adsorbé sur la surface de la phase stationnaire. L’interprétation la plus simple du mécanisme de rétention résultant est une combinaison d’échange d’ions avec le mécanisme à phase inversée. Lorsque la concentration du réactif à paires d’ions dans la phase mobile augmente, la rétention des analytes chargés de manière opposée augmente initialement, puis se stabilise à des concentrations plus élevées. Pour les réactifs à paires d’ions ayant une longueur de chaîne différente, la rétention augmente plus rapidement avec une longueur de chaîne plus longue.

Un autre effet d’interaction ionique rencontré avec les analytes cationiques est l’augmentation de la rétention lorsque de petits contre-ions inorganiques sont ajoutés à la phase mobile. Les concentrations requises sont généralement environ 10 fois plus élevées que les concentrations utilisées avec les réactifs à paires d’ions. Les anions typiques de ce type sont le perchlorate (ClO4-), le tétrafluoroborate (BF4−) ou l’hexafluorophosphate (PF6−). Ils augmentent considérablement la rétention des analytes cationiques. L’effet est plus prononcé avec l’acétonitrile comme additif de phase mobile qu’avec le méthanol. Ceci s’explique par une couche plus épaisse d’acétonitrile adsorbée sur la phase stationnaire par rapport à une couche monomoléculaire de méthanol, et le partitionnement du contre-ion dans cette couche. Du point de vue des utilisateurs, le comportement de rétention des analytes cationiques en présence de ces anions inorganiques n’est pas différent de celui observé avec les réactifs à paires d’ions véritables, c’est-à-dire avec les acides sulfoniques à longue chaîne.