Matériel végétal

Des observations et des analyses chimiques ont été menées de 2011 à 2018 sur une collection de plantes cultivées dans le jardin expérimental du campus de l’Université Louvain-la-Neuve (50°39’55 » N; 4°37’11 » E ). Avant et pendant leur période de floraison (juillet-août), les plantes ont été placées dans les chambres de croissance de l’Université dans des conditions contrôlées (24/22 ° C; 16 L: 8D, HR 80 ± 10%).

Matériel d’insectes

Les principales espèces d’insectes visiteurs d’A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum et B. terrestris) ont été utilisées dans des essais d’attractivité florale et de préférence gustative. Les individus d’A. mellifera et de B. pascuorum (10 par test et traitement) ont été recueillis dans la nature autour du campus universitaire (au moins quatre emplacements par espèce) le matin avant les tests. Comme B. les individus de terrestris ne peuvent pas être facilement distingués sur le terrain (morphologie similaire pour plusieurs espèces), nous avons utilisé des bourdons de quatre ruches (Biobest, Westerloo, Belgique) placées à proximité des bâtiments de l’université pour obtenir des individus à expérimenter.

Traits floraux

Dénombrements de pollen

Les anthères de 10 fleurs aux phases mâle et femelle ont été collectées, comptées, séchées et placées sur un tamis (90 µm) pour être frottées afin de recueillir les grains de pollen. La quantité de grains de pollen a été pesée. Des comptages polliniques ont été effectués à l’Université Lille-1 (Unité Evo-Eco-Paléo). Nous avons utilisé un compteur de particules pour estimer le nombre de grains de pollen dans ces échantillons. La veille du comptage du pollen, les échantillons ont été placés dans un tube chauffant jusqu’à ce que la majeure partie de l’éthanol s’évapore. Nous avons ensuite forcé la déhiscence des anthères en plaçant des échantillons dans un four à 56 °C pendant la nuit. Nous avons ajouté 1 mL d’eau distillée à chaque échantillon de pollen. Des tubes ont ensuite été soniqués et vortexés pour séparer les grains de pollen des anthères et les uns des autres. Une solution de pollen (200 µL) a ensuite été diluée dans 5 mL de tampon de mesure isotonique (tonne CASY®). Le compteur de particules a analysé trois échantillons de 400 µL de la suspension de pollen, fournissant un nombre total de particules dans ce volume de 1200 µL, ainsi que des comptes pour 400 classes de taille allant de 0,125 à 150 µm. Des comparaisons avec des échantillons vierges nous ont permis d’identifier des pics de particules, de taille allant de 20 à 30 µm, ce qui correspond à des grains de pollen. Le nombre de grains de pollen par anthère a été estimé en multipliant les valeurs fournies par le compteur de particules par le taux de dilution (i.e. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Couleur et morphologie des fleurs

Nous avons mesuré les traits floraux (longueur de la corolle, diamètre de la corolle, couleur florale et réflectance UV) sur 10 fleurs par phase (de 10 individus différents). La largeur du casque, la longueur et le diamètre de la corolle ont été mesurés à l’aide d’un étrier. Nous avons mesuré le spectre de réflexion des couleurs tépales à l’aide d’un spectromètre à fibre optique (Avaspec-ULS2048) et d’une source de lumière pulsée au xénon (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Pays-Bas). Pour les mesures de réflectance UV, les fleurs ont été fixées sur un fond noir et photographiées avec un Nikon D40 (Optique côtière 60 mm 1:4 Filtre UV-VIS-IR ApoMacro; Filtre X-Nite 330).

Collection florale volatile

Nous avons échantillonné des composés organiques volatils (COV) provenant de fleurs intactes en phase mâle et femelle (N =4 pour chaque phase). Chaque fleur a été insérée individuellement dans une ampoule en verre (longueur 50 mm et diamètre 30 mm), avec une ouverture de 17 mm de diamètre. Pour éviter la contamination de l’air, un tube en téflon rempli de charbon actif a été connecté à une extrémité de l’ampoule en verre et deux tubes en verre Tenax TA (6 mm × 4 mm, 7 pouces; 60-80 mesh, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Belgique) ont été connectés à l’autre extrémité. Les tubes Tenax ont été raccordés à des pompes à air calibrées (Gilair plus, Sensidyn, Saint-Pétersbourg, USA) à un débit de 50 mL * min-1 pendant 180 min (entre 11h00 et 14h00). Les conditions de laboratoire variaient entre 21,5 et 23,5 °C avec 45 à 55% d’HR.

Les COV piégés ont ensuite été désorbés thermiquement sur un chromatographe en phase gazeuse Agilent 6800 équipé d’une unité de thermodésorption Gerstel TDU et d’un cryocooleur CIS maintenus à -50 °C. Immédiatement après la thermodésorption, l’unité Cis T° a été programmée de -50 °C à 300 °C à 12 °C sec−1. L’appareil GLC a été couplé à un spectromètre de masse Agilent 7975 C. Les conditions analytiques étaient les suivantes: injection en mode split (avec un rapport de split de 50: 1, hélium à 1,6 mL min−1 comme gaz vecteur), colonne VF-Max MS 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) (Agilent). Le programme de température permettant la meilleure séparation (essais préliminaires non représentés) a été fixé comme suit : 40 °C (5 min) puis à 75 °C à 4 °C min−1 et à 115 °C (3 °C min−1) et enfin à 250 °C à 13 °C min−1. Les conditions de MS étaient les suivantes: Mode EI à 70 eV, source T ° = 250 ° C, quadripôle MS à 200 ° C et plage de masse balayée de 35 à 500 amu.

Les chromatogrammes enregistrés ont été systématiquement interprétés pour rechercher des COV spécifiques aux phases mâles ou femelles. Une fois détectées, les molécules ont été identifiées selon des bases de données calculées (Wiley 250.L et PAL 600). Les identifications ont été corroborées sur la base des données de rétention de molécules pures disponibles dans le commerce. Ils ont également été quantifiés par rapport à un étalon interne très pur (limonène, solution de 1 µL de méthanol à 0.67 µg µL1 ajoutés automatiquement à chaque tube de désorption avant le processus thermique).

L’air ambiant a également été recueilli comme témoin pour identifier les contaminants de fond. Pour éviter une éventuelle percée, une deuxième cartouche de verre chargée du même adsorbant (Tenax TA) a été systématiquement placée en tandem. L’analyse n’a révélé aucune trace des molécules d’intérêt.

Collecte et analyses d’alcaloïdes

Des anthères ont été prélevées sur 50 fleurs (de 10 individus), séchées puis broyées sur un tamis (90 µm) pour recueillir les grains de pollen. Trois répliques de 15 mg de pollen ont été échantillonnées pour rechercher des alcaloïdes. Les échantillons ont été congelés (-80 °C) pendant 2 h puis lyophilisés. Des échantillons secs ont été broyés en une poudre fine avec de l’azote liquide et des quantités pesées de poudre ont été placées dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL (Eppendorf, Hambourg, Allemagne). Les alcaloïdes ont été extraits à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire (nettoyeur à ultrasons VWR) pendant 10 min dans 100 µL de tampon d’extraction (méthanol aqueux à 70% et acide formique à 0,5%). Après centrifugation à 12 000 tr/min pendant 5 min (Centrifugeuse 5430 R), le surnageant a été transféré dans un tube microcentrifugeur de 1,5 mL. Après séchage dans un SpeedVac, les alcaloïdes ont été remis en suspension dans 200 µL de méthanol de qualité LC-MS et filtrés avec un filtre à seringue en PTFE de 0,45 µm (Whatman).

Le nectar a été collecté dans des tubes capillaires en verre de 5 µL (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Allemagne) à partir de 50 fleurs (de 10 individus). Trois répliques de 15 µL de nectar ont été séchées dans un SpeedVac et remises en suspension dans 200 µL de méthanol de qualité LC-MS avant filtration avec un filtre à seringue en PTFE de 0,45 µm (Whatman).

Des analyses chimiques ont été effectuées à l’aide d’un système LC-MS/MS composé d’une pompe Thermo Accela, d’un échantillonneur automatique, d’un détecteur à réseau de photodiodes et d’un détecteur de masse Thermo Scientific LTQ orbitrap XL (MASSMET, Institut de recherche sur les médicaments de Louvain, Woluwe, Belgique). Une colonne Phenomenex Gemini C18 a été utilisée (2 mm × 150 mm, remplie de particules de 3 µm). Un système de solvant binaire avec un débit de 300 µL min-1 a été utilisé: solvant A, eau de qualité HPLC (0,1% d’acide formique); et solvant B, méthanol de qualité LC-MS (0 min: 95% A, 10-12 min: 0% A, 13-17 min: 95% A). Un volume de 10 µL a été injecté et la température de la colonne a été réglée à 30 °C. Une MS haute résolution a été réalisée avec une source d’ionisation électrospray en mode positif. Les conditions d’entrée suivantes ont été appliquées: température capillaire, 275 ° C; tension capillaire, 13 V; lentille de tube, 140 V; débit de gaz de gaine, 30 a.u.; et débit de gaz auxiliaire, 10 u.a. L’acquisition et le traitement des données ont été effectués avec le logiciel Xcalibur. Cette méthode couvrait la gamme de masse de tous les alcaloïdes (MW de 329 à 673). Les alcaloïdes du pollen et du nectar ont été détectés et provisoirement identifiés par la SEP à haute résolution. La fragmentation obtenue par dissociation induite par collision a aidé à l’identification. Les concentrations d’alcaloïdes ont été calculées sur la base d’une courbe étalon d’aconitine dans le MeOH et exprimées en  » équivalent d’aconitine ”. Les alcaloïdes analysés ont été sélectionnés en fonction de leur présence dans d’autres espèces d’aconitum4,8.

Production de nectar et composition en sucre

Le nectar a été collecté dans des tubes capillaires en verre de 5 µL (Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Allemagne) à partir de fleurs des plantes transférées dans les chambres de croissance du campus universitaire (pas de visites d’insectes). Nous avons estimé la tendance de la production de nectar pendant la journée au début de l’anthèse en échantillonnant 2 fleurs de 12 individus toutes les 2 heures pendant 10 heures. Nous avons également mesuré la production totale de nectar par fleur (2 fleurs de 12 individus) pour les mêmes fleurs tous les 2 jours pendant toute la durée de vie des fleurs (9 jours), à la même heure chaque jour, 2 heures après l’allumage de la lumière. La production totale pour les phases mâles et femelles a été estimée à partir de l’échantillonnage à la fin des phases mâles (5 jours après l’anthèse) et femelles (8 jours).

Les échantillons de nectar ont été stockés à -80 °C jusqu’à ce que des analyses chimiques soient effectuées. Après dérivation, l’identification et la quantification du sucre ont été effectuées par GC-MS (Thermo Trace 1310 / Thermo ISQ-QD). Une colonne Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df) a été utilisée. Le débit était de 1,0 mL min-1 (hélium). Les rapports de fractionnement injectés sont de 1/10 pour les hexoses et de 1/100 pour le saccharose. Les conditions d’entrée suivantes ont été appliquées: température du four, 105 °C pendant 4 min, puis à 280 °C à 15 °C min-1 (pendant 20 min) et température de l’injecteur de 250 °C.La teneur totale en sucre du nectar par fleur (mg) a ensuite été calculée en volume de nectar (µL) x concentration totale en sucre (mg/µL).

Comportement des insectes

En 2011 et 2012, des études ont été menées sur les quatre populations naturelles restantes dans les fagnes du sud de la Belgique. Parmi celles−ci, la réserve naturelle « Les Abattis » (49°40’50″N; 5°32’59″E) contient la population la plus importante et la plus dense (2970 m2 avec 1330 ±1030 fleurs A. napellus m-2). À « Fouches » (49°4’8″ N; 5°43’06 » E), qui a la deuxième plus grande population (1788 m2), des individus de A. les napellus étaient très dispersés dans la région et à des densités beaucoup plus faibles (176 ± 177 fleurs m−2) « Chantemelle’ (49 °39’37″N; 5 °39’37″E)’ avait une population discontinue composée de trois parcelles (161, 423 et 500 m2) avec des densités de plantes et de fleurs relativement faibles (179 ± 125 fleurs m−2). « Sainte-Marie » (49°40’06 » N; 5°32’56 » E) avait une population minuscule et inégale (292 m2, 152 ±163 fleurs m−2) s’étendant sur environ 150 m le long d’une ancienne voie ferrée.

Les visiteurs de fleurs ont été enregistrés lors d’observations de 10 minutes pendant le pic de floraison sur trois jours consécutifs en 2011 (entre le 30 août et le 3 septembre) et sur quatre jours en 2012 (entre le 21 et le 27 août) avec des conditions météorologiques sèches et chaudes. La proportion de fleurs mâles en phase, au cours de ces jours et dans toutes les populations, était supérieure à celle des fleurs femelles en phase (environ 85%). Des fleurs de moins de 1 m2 (soit environ cinq plantes) ont été observées en même temps. Un minimum de dix observations par population ont été effectuées (maximum 16), réparties sur l’ensemble des populations et à différents moments de la journée. Pour chaque visiteur, nous avons enregistré l’espèce, le nombre de fleurs volées et non volées visitées par plante et par parcelle, le temps passé par fleur unique ainsi que leur comportement de recherche de nourriture (collecte de pollen ou de nectar, visite légitime ou illégitime, appelée vol (travail de base, vol primaire et secondaire). Pendant 530 min d’observations de fleurs en 2011 et 400 min en 2012, nous avons enregistré 183 visiteurs de fleurs. Les bourdons (B. pascuorum et B. hortorum) et les abeilles mellifères (Apis mellifera) étaient les principaux visiteurs de fleurs; seuls 3 individus de B. terrestris ont été observés.

Capacité de charge du pollen

Trente individus par espèce ont été tués avec de l’acétate d’éthyle et stockés individuellement. Le pollen a été retiré des différentes parties du corps de l’insecte avec de petits cubes de gélatine-glycérine53. Les grains de pollen concentrés dans les corbicules ont été éliminés et n’ont pas été inclus dans les analyses. Tous les grains de pollen ont été comptés par microscopie optique.

Pureté de la collecte du pollen

Nous avons échantillonné des charges de pollen de bourdons visitant A. napellus dans les populations naturelles. En laboratoire, des charges de pollen ont été acétolysées53. Au moins 400 grains de pollen choisis au hasard de chacune des 25 charges de pollen ont été identifiés et comptés en microscopie optique.

Réponses gustatives des visiteurs d’insectes

Nous avons suivi le protocole de Ma et al.54 pour la détection de l’aconitine. Une fois capturées, les abeilles individuelles ont été affamées pendant 3 heures dans un flacon en plastique (7 cm de long, 2,8 cm de diamètre intérieur) à température ambiante et dans l’obscurité totale dans le laboratoire. Nous avons transféré chaque abeille dans un tube de maintien, un tube à centrifuger de 15 mL avec un trou de 4 mm percé à l’extrémité et un morceau de treillis d’acier fixé à l’intérieur. Après une phase de pré-test avec une gouttelette de saccharose, nous avons présenté la solution d’essai dans un tube capillaire en verre de 100 µL et pressé doucement le tube pour maintenir la solution à l’extrémité du tube. Tout insecte sans extension de trompe après 5 minutes a été retiré du test. Les phases de test ont duré 2 minutes et le volume de la solution avant et après le test a été enregistré avec un étrier.

Des tests ont été effectués avec trois espèces visiteuses (A. mellifera, B. pascuorum et B. terrestris). Dix individus par espèce d’insecte ont été testés avec chaque solution. Les concentrations de saccharose (430 µg mg−1) et d’aconitine (232 µg g−1) correspondaient à celles trouvées chez notre espèce. Trois solutions ont été présentées : eau désionisée seule (témoin), solution de saccharose pure et solution de saccharose plus aconitine.

Pour tous les tests, un indice de dissuasion a été calculé pour chaque sujet à partir du choix de boire, du volume de solution consommé et du temps de contact avec la solution comme suit: ID = 1 – (choix pour le saccharose / choix pour le saccharose + aconitine) × (volume consommé de saccharose / volume consommé de saccharose + aconitine) × (temps de contact avec la solution de saccharose / temps de contact avec la solution de saccharose + aconitine).

Analyses statistiques

La normalité des données a été estimée à l’aide de tests de Shapiro–Wilk, et l’homoscédasticité a été vérifiée à l’aide des tests de Levene. Lorsque les exigences de normalité et d’homoscédasticité ont été remplies, des analyses de variance (ANOVAs) ont été effectuées (effet de phase florale sur les volatiles floraux). Sinon, des tests non paramétriques ont été effectués à l’aide du test de Wilcoxon pour comparer deux conditions (effet de la phase florale sur la morphologie des fleurs et les paramètres du nectar) et du test de Kruskall-Wallis pour comparer plus de deux conditions (effet de l’insecte et de la solution sur le volume consommé et la durée de contact avec la solution dans les expériences gustatives, effet de l’insecte sur le comportement de visite) et des tests du chi carré ont été effectués pour comparer les pourcentages d’individus dans les expériences gustatives. Les analyses ANOVA et non paramétriques ont été suivies d’une comparaison multi-paires lorsque plus de deux conditions ont été comparées. Toutes les analyses ont été effectuées dans SAS Enterprise Guide 7.1. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écarts types.