Robert Neville semble être le seul survivant d’une pandémie qui a tué la majeure partie de la population humaine et transformé le reste en « vampires » qui se conforment largement à leurs stéréotypes dans la fiction et le folklore: ils sont suceurs de sang, à la peau pâle et nocturnes, bien qu’autrement indiscernables des humains normaux. Situé implicitement à Los Angeles en 1976, le roman détaille la vie de Neville dans les mois et éventuellement les années qui ont suivi l’épidémie alors qu’il tente de comprendre, de rechercher et éventuellement de guérir la maladie. Des essaims de vampires entourent sa maison tous les soirs et tentent de trouver des moyens d’entrer à l’intérieur, ce qui inclut les femelles qui s’exposent et son voisin vampire criant sans relâche pour qu’il sorte. Neville survit en se barricadant dans sa maison chaque nuit; il est en outre protégé par les répulsifs traditionnels contre les vampires, à savoir l’ail, les miroirs et les crucifix. Des tempêtes de poussière hebdomadaires ravagent la ville, et pendant la journée, lorsque les vampires sont inactifs, Neville se promène pour les rechercher afin de les tuer avec des pieux en bois (car ils semblent imperméables aux balles de ses fusils) et de chercher des provisions. Le passé de Neville est parfois révélé par des flashbacks; la maladie a revendiqué sa fille, dont le corps le gouvernement l’a forcé à brûler, ainsi que sa femme, dont il a secrètement enterré le corps mais a ensuite dû le tuer après qu’elle soit ressuscitée d’entre les morts en tant que vampire.

Après des épisodes de dépression et d’alcoolisme, Neville détermine finalement qu’il doit y avoir des raisons scientifiques derrière les origines, les comportements et les aversions des vampires, alors il entreprend d’enquêter. Il obtient des livres et d’autres documents de recherche d’une bibliothèque et, grâce à des recherches progressives, découvre que la racine de la maladie est probablement une souche de bacille de bactéries capables d’infecter à la fois des hôtes décédés et des hôtes vivants. Ses expériences avec des microscopes révèlent également que les bactéries sont mortellement sensibles à l’ail et à la lumière du soleil. Un jour, un chien errant et blessé trouve son chemin dans sa rue, remplissant Neville de joie émerveillée. Désespéré par la compagnie, Neville gagne minutieusement la confiance du chien nerveux avec de la nourriture et l’apporte à la maison. Malgré ses efforts, le chien maladif meurt une semaine plus tard et Neville, privé de tout espoir, revient résigné pour en savoir plus sur les vampires.

Les lectures et expériences continues de Neville sur les vampires incapables l’aident à créer de nouvelles théories. Il pense que les vampires sont affectés par les miroirs et les croix en raison de la « cécité hystérique », résultat du conditionnement psychologique antérieur des personnes infectées. Rendus fous par la maladie, les infectés réagissent maintenant comme ils le pensent lorsqu’ils sont confrontés à ces objets. Même alors, leur réaction est limitée aux croyances de la personne en particulier; par exemple, un vampire chrétien craindrait la croix, mais pas un vampire juif. Neville découvre en outre des moyens plus efficaces de tuer les vampires, autres que de simplement enfoncer un pieu dans leur cœur. Cela inclut d’exposer les vampires à la lumière directe du soleil ou d’infliger de larges plaies exposant à l’oxygène n’importe où sur leur corps, de sorte que les bactéries passent du statut de symbiotes anaérobies à des parasites aérobies, consommant rapidement leurs hôtes lorsqu’ils sont exposés à l’air, ce qui donne l’apparence des vampires se liquéfiant instantanément. Cependant, les bactéries produisent également une « colle corporelle » résiliente qui scelle instantanément les plaies émoussées ou étroites, rendant les vampires à l’épreuve des balles. Grâce à ses nouvelles connaissances, Neville tue un si grand nombre de vampires dans ses incursions quotidiennes que ses visiteurs nocturnes ont considérablement diminué. Neville pense en outre que la pandémie s’est propagée non pas tant par des piqûres directes de vampires que par des moustiques porteurs de bactéries et des tempêtes de poussière dans les villes à la suite d’une récente guerre. L’incohérence des résultats de Neville dans la manipulation des vampires l’amène également à réaliser qu’il existe en fait deux types de vampires réagissant différemment: ceux conscients et vivant avec une infection qui s’aggrave et ceux qui sont morts mais ont été réanimés par la bactérie (i.e. morts-vivants).

Après trois ans, Neville voit une femme terrifiée en plein jour. Neville se méfie immédiatement après avoir reculé violemment en présence d’ail, mais ils gagnent lentement la confiance de l’autre. Finalement, les deux se réconfortent de manière romantique et il explique certaines de ses découvertes, y compris sa théorie selon laquelle il a développé une immunité contre l’infection après avoir été mordu par une chauve-souris vampire infectée il y a des années. Il veut savoir si la femme, nommée Ruth, est infectée ou immunisée, jurant de la traiter si elle est infectée, et elle lui permet à contrecœur de prélever un échantillon de sang mais le frappe soudainement inconscient alors qu’il voit les résultats. Lorsque Neville se réveille, il découvre une note de Ruth avouant qu’elle est bien un vampire envoyé pour l’espionner et qu’il est responsable de la mort de son mari, un autre vampire. La note suggère en outre que seuls les vampires morts-vivants sont pathologiquement violents, mais pas ceux qui étaient vivants au moment de l’infection et qui survivent encore en raison de mutations accidentelles dans leurs bactéries. Ces personnes infectées vivantes ont lentement surmonté leur maladie et tentent de construire une nouvelle société. Ils ont mis au point des médicaments qui atténuent le pire de leurs symptômes. Ruth avertit Neville que ses sentiments pour lui sont vrais mais que son peuple tentera de le capturer et qu’il devrait essayer de s’échapper de la ville.

Cependant, en supposant qu’il sera traité équitablement par la nouvelle société, Neville reste chez lui jusqu’à ce que les membres infectés arrivent et envoient violemment les vampires morts-vivants à l’extérieur de sa maison avec une joie diabolique. Réalisant que les attaquants infectés ont peut-être l’intention de le tuer après tout, il tire sur eux et est à son tour abattu et capturé. Mortellement blessé, Neville est placé dans une cellule interdite où il reçoit la visite de Ruth, qui l’informe qu’elle est un membre senior de la nouvelle société mais, contrairement aux autres, ne lui en veut pas. Après avoir discuté des effets des activités de meurtre de vampires de Neville sur la nouvelle société, elle reconnaît la nécessité publique de l’exécution de Neville mais, par pitié, lui donne un paquet de pilules suicidaires à action rapide. Neville accepte son sort et demande à Ruth de ne pas laisser cette société devenir trop sans cœur. Ruth promet d’essayer, l’embrasse et s’en va. Neville se rend à la fenêtre de sa prison et voit les infectés le regarder avec la même haine et la même peur qu’il avait autrefois ressenties pour eux; il se rend compte que lui, un reste de la vieille humanité, est maintenant une légende de la nouvelle race née de l’infection. Il reconnaît que leur désir de le tuer, après avoir tué tant de leurs proches, n’est pas quelque chose qu’il peut condamner. Alors que les pilules prennent effet, il est amusé par la pensée qu’il deviendra leur nouvelle superstition et légende, tout comme les vampires l’étaient autrefois pour les humains.