Réalisation de la CLHP

Introduction

La chromatographie en phase liquide à haute performance est essentiellement une forme hautement améliorée de chromatographie sur colonne. Au lieu de laisser un solvant s’égoutter à travers une colonne par gravité, il est forcé à traverser sous des pressions élevées allant jusqu’à 400 atmosphères. Cela le rend beaucoup plus rapide.

Il permet également d’utiliser une taille de particule beaucoup plus petite pour le matériau d’emballage de la colonne, ce qui donne une surface beaucoup plus grande pour les interactions entre la phase stationnaire et les molécules qui la traversent. Cela permet une bien meilleure séparation des composants du mélange.

L’autre amélioration majeure par rapport à la chromatographie sur colonne concerne les méthodes de détection utilisables. Ces méthodes sont hautement automatisées et extrêmement sensibles.

La colonne et le solvant

De manière confuse, il existe deux variantes d’utilisation en CLHP en fonction de la polarité relative du solvant et de la phase stationnaire.

HPLC en phase normale

C’est essentiellement la même chose que vous avez déjà lue en chromatographie sur couche mince ou en chromatographie sur colonne. Bien qu’il soit décrit comme « normal », ce n’est pas la forme la plus couramment utilisée de CLHP.

La colonne est remplie de minuscules particules de silice et le solvant est par example l’hexane non polaire. Une colonne typique a un diamètre interne de 4,6 mm (et peut être inférieur à celui-ci) et une longueur de 150 à 250 mm.

Les composés polaires du mélange passant dans la colonne colleront plus longtemps à la silice polaire que les composés non polaires. Les non polaires passeront donc plus rapidement à travers la colonne.

CLHP en phase inversée

Dans ce cas, la taille de la colonne est la même, mais la silice est modifiée pour la rendre non polaire en attachant de longues chaînes hydrocarbonées à sa surface – généralement avec 8 ou 18 atomes de carbone. Un solvant polaire est utilisé – par exemple, un mélange d’eau et d’un alcool tel que le méthanol.

Dans ce cas, il y aura une forte attraction entre le solvant polaire et les molécules polaires dans le mélange passant dans la colonne. Il n’y aura pas autant d’attraction entre les chaînes hydrocarbonées attachées à la silice (la phase stationnaire) et les molécules polaires de la solution. Les molécules polaires du mélange passeront donc la majeure partie de leur temps à se déplacer avec le solvant.

Les composés non polaires du mélange auront tendance à former des attraits avec les groupes hydrocarbonés en raison des forces de dispersion de van der Waals. Ils seront également moins solubles dans le solvant en raison de la nécessité de rompre les liaisons hydrogène lorsqu’ils se pressent entre les molécules d’eau ou de méthanol, par exemple. Ils passent donc moins de temps en solution dans le solvant et cela les ralentira dans leur passage dans la colonne.

Cela signifie que maintenant ce sont les molécules polaires qui parcourront la colonne plus rapidement.

La CLHP en phase inversée est la forme la plus couramment utilisée de la CLHP.