GDF11PRO-Fc se une a GDF11 y MSTN

Para mostrar que GDF11PRO-Fc puede secuestrar el dímero GDF11 maduro activo a través de una interacción directa, nuestro objetivo es identificar una interacción proteína-proteína entre GDF11 y GDF11PRO-Fc. Además, debido a la estrecha homología estructural de los dímeros maduros GDF11 y MSTN, también queríamos determinar si GDF11PRO-Fc se asocia con MSTN. Para identificar estas interacciones proteína-proteína, realizamos un conjunto de ensayos de extracción (Fig. 1). Los ligandos rGDF11, rMSTN y Ractivina A se incubaron con fracciones de lisado de células HEK293 transfectadas con un plásmido que codifica para GDF11PRO-Fc o MPRO-Fc a pH 7,4. Debido a los fragmentos de Fc conjugados en los propéptidos modificados, las fracciones se podían tirar hacia abajo directamente sobre una resina de agarosa de proteína A/G. Como era de esperar, GDF11PRO-Fc efectivamente derribó tanto rGDF11 como rMSTN, lo que indica que GDF11PRO-Fc era capaz de unir ambos ligandos. Además, MPRO-Fc derribó con éxito tanto rGDF11 como rMSTN. Tanto GDF11PRO-Fc como MPRO-Fc no fueron capaces de derribar el ligando Ractivina A de la superfamilia TGF-β más distante, lo que indica que la unión del ligando es específica (Fig. 1). No se observó unión de GDF11PRO-Fc, MPRO-Fc, rGDF11, rMSTN o ractivina A en una resina de agarosa de control sin proteína A / G. A partir de estos resultados, concluimos que GDF11PRO-Fc se asocia espontáneamente con los dímeros maduros GDF11 y MSTN a pH fisiológico.

GDF11PRO-Fc se asocia con GDF11 y MSTN. Las interacciones proteína-proteína entre GDF11PRO-Fc o MPRO-Fc y rGDF11, rMSTN o Ractivina A se determinaron mediante un ensayo desplegable. GDF11PRO-Fc o MPRO-Fc se incubó con rGDF11, rMSTN o rActivin A durante 1 h a 4 °C. Los complejos de proteínas fusionadas con Fc se separaron en una resina de agarosa recubierta de proteína A/G y los eluatos se corrieron en un gel de página SDS al 12% en condiciones reductoras y se probaron con western blot. El control de entrada fue del 5% del material de entrada. WB western blot

Bloques GDF11PRO-Fc Atrofia inducida por GDF11/MSTN en miotubos C2C12

Se ha demostrado previamente que la adición de rGDF11 y rMSTN a miotubos diferenciados induce atrofia en C2C12 murino y esquelético humano primario miotubos . Habiendo determinado que GDF11PRO-Fc se une a GDF11 y MSTN, a continuación preguntamos si GDF11PRO-Fc podría prevenir la atrofia de miotubos inducida por GDF11/MSTN en miotubos C2C12 diferenciados. Para lograr esto, empaquetamos la codificación de secuencia de ADN para GDF11PRO-Fc en la cápside AAV6 para generar el vector AAV6-GDF11PRO-Fc. En estos experimentos, el vector AAV6 fue seleccionado por su capacidad de transducir de manera eficiente y selectiva miotubos C2C12 diferenciados, pero no mioblastos . Los mioblastos C2C12 se cultivaron y diferenciaron durante 5 días antes del tratamiento con AAV6-GDF11PRO-Fc o AAV6-EGFP (vector de control) a un MOI de 105 (Fig. 2a). Como era de esperar, la expresión de GFP fue observable en miotubos C2C12 infectados con AAV6-EGFP a las 48-72 h post-infección, y la cuantificación de copias del genoma vectorial internalizado por genoma diploide a las 72 h post-infección indicó que la transducción vectorial se logró adecuadamente (Fig. 2b y c).

GDF11PRO-Fc bloquea la atrofia de miotubos inducida por GDF11 / MSTN en células C2C12. un esquema que detalla la línea de tiempo experimental en miotubos C2C12. Se añadió AAV6-EGFP o AAV6-GDF11PRO-Fc a los miotubos C2C12 con un MOI de 105 el día 5 después de la diferenciación y se añadieron 100 ng/ml rGDF11 o rMSTN el día 7. Los miotubos fueron teñidos y analizados el día 10. b La expresión de EGFP fue evidente a las 48-72 h en miotubos C2C12 tratados con AAV6-EGFP (MOI 10 ). Las barras de escala representan 50 µm. c Número de copias del genoma vectorial por genoma diploide en miotubos C2C12 72 h después de la adición de AAV6-EGFP o AAV6-GDF11PRO-Fc (MOI 10 ). d Imágenes representativas de inmunofluorescencia de miotubos C2C12. Las membranas de los miotubos C2C12 se visualizaron mediante tinción con un anticuerpo anti-distrofina (rojo). Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). El recuadro muestra una región ampliada. Las barras de escala representan 50 µm (panel principal) y 25 µm (panel insertado). e Se calculó la fracción de núcleos incorporados en miotubos (índice de diferenciación) y se presentó como porcentaje del control. f Diámetro medio del miotubo en relación con el control y (g) distribución de las mediciones de diámetro. Para las mediciones del diámetro del miotubo, cada miotubo se midió en tres puntos a lo largo de la longitud del miotubo y se promedió. h Número de núcleos incorporados por miotubo. Se analizó un mínimo de 50 miotubos por condición experimental. i pSMAD2/3 relativo a tSMAD2 / 3 fue evaluado por western blot. La carga igual de proteínas se verificó mediante tinción de Ponceau y se utilizó GAPDH como control de carga. Los datos representan los resultados de tres experimentos separados. Todas las barras de error representan media ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. not significant; compared to AAV6-EGFP-treated control. †p < 0.05; ††p < 0.01; †††p < 0.001; compared to AAV6-EGFP + ligand-treated. pSMAD2/3: phosphorylated SMAD2/3; tSMAD2/3: total SMAD2/3

Forty-eight hours after AAV treatment, rGDF11 or rMSTN was added to the media to a final concentration of 100 ng/ml. Setenta y dos horas más tarde, los miotubos se fijaron y teñieron para el análisis de inmunofluorescencia utilizando una distrofina de reconocimiento de anticuerpos (varilla 22/varilla 23) para visualizar las membranas periféricas de los miotubos y la DAPI para teñir los mionucleos (Fig. 2d). En los miotubos tratados con rGDF11 (− 15%, p = 0,0008) o rMSTN (− 14%, p = 0,0013) se observó una reducción en el índice de diferenciación, que se define como la proporción de mionucleos incorporados a los miotubos, en relación con el control no tratado. Sin embargo, este efecto se atenuó en los miotubos C2C12 que expresan GDF11PRO-Fc tratados con rGDF11 (- 1,9%; p = 0.0047, comparado con el control tratado con rGDF11) o rMSTN (- 3,0%; p = 0,0040, comparado con el control tratado con rMSTN; Fig. 2e). Además, los miotubos C2C12 tratados con AAV6-GDF11PRO-Fc resistieron la atrofia de miotubos inducida por rGDF11 o rMSTN. En los miotubos tratados con rGDF11 (− 39%; 0,0002) o rMSTN (− 35%; p = 0,0003) se detectó una disminución sustancial en el diámetro promedio de los miotubos en relación con el control en comparación con el control. Por el contrario, los miotubos que expresan GDF11PRO-Fc tratados con rGDF11 (- 1,8%; p = 0,0005, en comparación con el control tratado con rGDF11) o rMSTN (- 5,3%; p = 0.0075, en comparación con el control tratado con rMSTN) no se vieron afectados en gran medida (Fig. 2f y g). En un experimento separado, GDF11PRO-Fc no fue capaz de prevenir la atrofia de miotubos inducida por ractivina A, lo que está en línea con la observación de que GDF11PRO-Fc no se une a la activina A (Archivo adicional 1: Figura S3).

el Tratamiento con rGDF11 o rMSTN también se asoció con una menor proporción de miotubos maduros con un mayor número de petequiales, lo que sugiere una inhibición de miotubos diferenciación. Miotubos con más de 11 petequiales compuesto sólo el 5,2% (p = 0.0215) y el 7,2% (p = 0.0328) de miotubos analizados en células tratadas con rGDF11 y rMSTN, respectivamente. En comparación, los miotubos con más de 11 núcleos constituyeron el 26% de los miotubos analizados en los miotubos de control. En los miotubos que expresaban GDF11PRO-Fc tratados con rGDF11 o rMSTN, la proporción de miotubos con más de 11 mionucleos fue del 22% (p = 0,0104, en comparación con el control tratado con rGDF11) y del 19% (p = 0,0404, en comparación con el control tratado con rMSTN), respectivamente (Fig. 2h). Finalmente, de acuerdo con lo que se esperaría después de la señalización GDF11/MSTN en ActRII, se observó un aumento en los niveles de proteínas SMAD2/3 (pSMAD2/3) fosforiladas en miotubos tratados con AAV6-EGFP y rGDF11 o rMSTN en western blot 24 h después de la adición de ligando (Fig. 2i). Este aumento en los niveles de pSMAD2/3 estuvo ausente en los miotubos tratados con AAV6-GDF11PRO-Fc, lo que sugiere que la expresión de GDF11PRO-Fc antagoniza la activación inducida por GDF11/MSTN de SMAD2/3 en miotubos diferenciados. En general, estos resultados indican que GDF11PRO-Fc fue capaz de prevenir la atrofia de miotubos inducida por rGDF11 y rMSTN y la inhibición de la diferenciación en células C2C12.

La expresión localizada de GDF11PRO-Fc induce hipertrofia del músculo esquelético en ratones adultos

Anteriormente, hemos demostrado que la administración sistémica de genes mediados por vectores de AAV de GDF11PRO-Fc en ratones neonatales condujo a un aumento significativo en la tasa de crecimiento del músculo esquelético . Sin embargo, no estaba claro a partir de este estudio si el GDF11PRO-Fc simplemente aumentaba el crecimiento del músculo esquelético o si realmente inducía hipertrofia del músculo esquelético. Además, no fue posible determinar si los efectos de GDF11PRO-Fc estaban mediados por el bloqueo local de GDF11/MSTN en el músculo esquelético o si los efectos observados se debían a la modulación sistémica de GDF11/MSTN. Para abordar estas preguntas, evaluamos el impacto de la administración intramuscular de AAV9-GDF11PRO-Fc en ratones adultos C57BL/6J. En estos estudios, solo se inyectó la extremidad trasera del lado derecho, y se utilizó la extremidad trasera contralateral del lado izquierdo como control.

El peso corporal aumentó ligeramente con el tiempo en ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 10% a las 10 semanas; p = 0,0418; Fig. 3a). Además, la fuerza de agarre de una sola extremidad posterior normalizada al peso corporal aumentó significativamente en ambas extremidades analizadas individualmente, observándose una mayor magnitud de efecto en la extremidad posterior derecha tratada (+ 37%; p = 0,0177), aunque también se observó un aumento significativo de la fuerza de agarre normalizada en la extremidad posterior izquierda no tratada (+ 18%; p = 0,0426). Sin embargo, esta diferencia no alcanzó significación cuando se probaron simultáneamente ambas extremidades posteriores (+ 15%; p = 0,2375; Fig. 3b). Diez semanas después de la administración del vector, la extremidad posterior derecha era visiblemente más grande en ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3c). En ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc, la masa de tejido húmedo del tibial anterior del lado derecho inyectado (+ 50%; p = 0,0046) y gastrocnemio (+ 37%; p = 0,0023) fue significativamente mayor en comparación con los controles tratados con vehículos. No hubo diferencia estadísticamente significativa en la masa de tejido húmedo de los músculos de las extremidades posteriores del lado izquierdo no tratados (Fig. 3d). El análisis del área de miofibras reveló un aumento en el área de sección transversal media de miofibras (+15%; p = 0.0078) en el gastrocnemio derecho inyectado AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3e y f). El análisis de distribución de MFD también reveló un cambio hacia miofibras más grandes en el gastrocnemio del lado derecho de ratones inyectados con AAV9-GDF11PRO-Fc (Fig. 3g), indicando que la expresión localizada de GDF11PRO-Fc indujo hipertrofia muscular. En una cohorte separada, también evaluamos el impacto de la administración génica localizada de GDF11 mediante una inyección intramuscular de AAV9-GDF11 en la extremidad posterior del lado derecho, y se observó una atrofia muscular significativa 10 semanas después del tratamiento en la extremidad posterior inyectada (archivo adicional 1: Figura S4).

GDF11PRO-Fc induce hipertrofia localizada del músculo esquelético después de la administración intramuscular del gen. ratones C57BL/6J de 8 semanas de edad fueron tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 5) o vehículo (n = 5) mediante inyección intramuscular unilateral en la extremidad posterior derecha. La extremidad trasera contralateral del lado izquierdo no fue tratada. Los ratones fueron sacrificados 10 semanas después del tratamiento. un peso corporal promedio a lo largo del tiempo. b Fuerza de agarre de la extremidad posterior normalizada al peso corporal a las 10 semanas después del tratamiento. Se muestran las medidas de una sola extremidad trasera y de ambas. c Musculatura gruesa representativa de la extremidad posterior. La extremidad posterior inyectada está designada con una flecha negra. d Peso del tejido húmedo del tibial anterior y del gastrocnemio. e Imágenes representativas de inmunofluorescencia de secciones transversales inyectadas de gastrocnemio del lado derecho teñidas con AlexaFluor-488 WGA conjugado para visualizar miofibras. Las barras de escala representan 100 µm. f Área de sección transversal media de miofibras en el gastrocnemio derecho inyectado. g Distribución de miofibras MFD en el gastrocnemio derecho inyectado. Se midió un mínimo de 500 miofibras por ratón. h Western blot identificación de GDF11PRO-Fc en lisados tisulares de gastrocnemio del lado derecho inyectado y muestras de hígado de ratones tratados. GDF11PRO-Fc no fue detectable en ratones tratados con vehículos. La carga igual de proteínas se verificó mediante tinción de Ponceau y se utilizó GAPDH como control de carga. Todas las barras de error representan media ± SEM. *p < 0.05; **p < 0,01; n.s. no significativo, en comparación con los tratados con vehículo de control. TA tibial anterior, gastrocnemio gaseoso

El análisis Western blot indicó que la proteína GDF11PRO-Fc se expresó en el gastrocnemio derecho inyectado AAV9-GDF11PRO-Fc (banda de 58 kDa; Fig. 3h). Sin embargo, no se detectó GDF11PRO-Fc en el gastrocnemio izquierdo no tratado con la misma cantidad total de proteína cargada, lo que sugiere que la mayor parte de la expresión de GDF11PRO-Fc del músculo esquelético se localizó en la extremidad posterior del lado derecho inyectada (datos no mostrados). GDF11PRO-Fc también fue detectable en el hígado mediante western blot, lo que indica que se había producido alguna exposición sistémica (Fig. 3h). Esta observación puede atribuirse muy probablemente a la fuga vascular del vector AAV9 hacia la circulación sistémica desde el lugar de la inyección . A partir de estos datos, determinamos que GDF11PRO-Fc induce hipertrofia muscular esquelética en ratones adultos. Además, estos efectos están mediados, al menos parcialmente, por el bloqueo local de GDF11/MSTN en el músculo esquelético, probablemente a través de la inhibición de las interacciones del ligando con ActRII en el tejido muscular esquelético.

La entrega sistémica del gen GDF11PRO-Fc aumenta la masa y la fuerza del músculo esquelético en ratones mdx

A continuación, evaluamos el impacto de la expresión sistémica de GDF11PRO-Fc en ratones mdx para determinar si el GDF11PRO-Fc también podría inducir hipertrofia y aumentar la fuerza en el músculo esquelético distrófico. Para los propósitos de este ensayo, el constructo GDF11PRO-Fc se modificó con una mutación para hacerlo impermeable a la escisión de metaloproteinasa endógena similar a BMP1/TLD (GDF11PRO-Fc D122A) y aumentar la persistencia de los factores en la circulación sistémica . Para estos experimentos, se evaluaron tanto AAV9-GDF11PRO-Fc como AAV9-GDF11PRO-Fc D122A para establecer si el transgén D122A mutado conduciría a un efecto más pronunciado in vivo. Para lograr la expresión sistémica, los ratones mdx fueron tratados con vector o vehículo mediante inyección de vena de cola. Después de la administración intravenosa, el vector AAV9 transduce el hígado de ratón con alta eficiencia. Los hepatocitos transducidos pueden entonces expresar el transgén y secretar el producto proteico en la circulación sistémica .

A partir de las 3 semanas posteriores a la inyección, observamos un aumento significativo del peso corporal que persistió durante el ensayo con AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 7,7% a las 12 semanas; p = 0,0094) y AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 11% a las 12 semanas; p = 0,006) (Fig. 4a). Cabe señalar que, debido a la patología distrófica, los ratones mdx suelen presentar hipertrofia muscular compensatoria, que puede enmascarar parcialmente el aumento de la masa muscular inducido por la expresión de GDF11PRO-Fc. En lo que respecta a las pruebas de función muscular, los ratones tratados mostraron una mayor fuerza de agarre de los miembros delanteros, incluso después de normalizarse al peso corporal. Sin embargo, la diferencia en la fuerza de agarre normalizada de la extremidad anterior solo alcanzó significación estadística en el grupo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A. A las 12 semanas después del tratamiento, la fuerza media normalizada de agarre de la extremidad anterior aumentó en + 28% (p = 0,0873) y + 36% (p = 0,0248) en ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc y AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivamente (Fig. 4b). El rendimiento de Rotarod también mejoró con el tratamiento AAV9-GDF11PRO-Fc D122A en promedio (aumento de+ 93% en el tiempo de latencia de rotarod; p = 0,0127). El rendimiento de Rotarod también mejoró en el grupo AAV9-GDF11PRO-Fc, pero esta diferencia no alcanzó significación estadística (aumento de+ 44% en el tiempo de latencia de rotarod; p = 0,2835; Fig. 4c). No se observaron diferencias en el tiempo de marcha de la cinta de correr en ninguno de los grupos (Fig. 4d).

GDF11PRO-Fc mejora la fuerza de agarre y el rendimiento de rotarod en ratones distróficos mdx. ratones mdx de 6 semanas de edad fueron tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) o vehículo (n = 7) mediante inyección en la vena de la cola. un peso corporal promedio a lo largo del tiempo. b Fuerza de agarre de la extremidad anterior normalizada al peso corporal con el tiempo. c Mejor tiempo de caída de rotarod registrado desde antes del tratamiento (valor basal) y 12 semanas después del tratamiento. Se utilizó el mejor tiempo de tres intentos para el análisis. d Prueba de resistencia de recorrido de distancia total en cinta de correr desde el pretratamiento (valor basal) y 12 semanas después del tratamiento. Todas las barras de error representan media ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; n.s. no significativo; en comparación con el control tratado con el vehículo

Al final del 12-en un ensayo de una semana, la hipertrofia muscular fue muy evidente en los ratones tratados (Fig. 5a). Las masas medias de tejido húmedo del tibial anterior, el gastrocnemio y el cuádriceps aumentaron un + 17% (p = 0,0472), un + 20% (p = 0,0011) y un + 14% (p = 0).0333), respectivamente, en el grupo AAV9-GDF11PRO-Fc. En el grupo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, estos valores aumentaron aún más a + 26% (p = 0,0030), + 31% (p = 0,0003) y + 23% (p = 0,0009) sobre el control tratado con el vehículo para el cambio en la masa anterior promedio del tibial, la masa del gastrocnemio y la masa del cuádriceps, respectivamente. Además, la masa de tejido húmedo del diafragma se incrementó en + 19% (p = 0,0162) y + 26% (p = 0,0014) en los grupos AAV9-GDF11PRO-Fc y AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivamente. Curiosamente, la masa cardíaca no se modificó significativamente con el tratamiento. El área de sección transversal de miofibras gastrocnemias promedio fue mayor en ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (+ 23%; p = 0,0226) y AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (+ 25%; p = 0,0170; Fig. 5c y d). En el análisis de distribución de MFD, el MFD tendió a alcanzar un pico de alrededor de 20-30 µm en todos los grupos, lo que probablemente se deba a la mayor proporción de miofibras pequeñas regeneradoras en el músculo distrófico. Sin embargo, el tratamiento con AAV9-GDF11PRO-Fc y AAV9-GDF11PRO-Fc D122A resultó en un aumento de la proporción de miofibras con MFD superiores a 64 µm, lo que sugiere que la expresión de los factores había inducido hipertrofia de miofibras (Fig. 5e) en el músculo esquelético.

GDF11PRO-Fc induce hipertrofia muscular esquelética en ratones distróficos mdx. ratones mdx de 6 semanas de edad fueron tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) o vehículo (n = 7) mediante inyección en la vena de la cola. Los ratones fueron sacrificados 12 semanas después del tratamiento. musculatura gruesa representativa de la extremidad posterior. b Peso del tejido húmedo de los músculos de las extremidades, el diafragma y el corazón. c Imágenes representativas de inmunofluorescencia de secciones transversales de gastrocnemio teñidas con WGA conjugado con AlexaFluor-488 para visualizar miofibras. Las barras de escala representan 100 µm. d Área de sección transversal media de miofibras en el gastrocnemio. e Distribución de miofibras MFD en el gastrocnemio. Se midió un mínimo de 500 miofibras por ratón. f Identificación de GDF11PRO-Fc por western blot en lisado de tejido hepático y suero de ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc. La carga igual de proteínas se verificó mediante tinción de Ponceau y se utilizó GAPDH como control de carga en lisados de tejido hepático. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n.s. no significativo, en comparación con los tratados con vehículo de control

el análisis de Western blot confirmó la proteína de expresión de los transgenes en el hígado y suero. Como era de esperar, la banda de 58 kDa correspondiente a GDF11PRO-Fc de longitud completa o GDF11PRO-Fc D122A fue detectable en ratones tratados. Los niveles séricos del propéptido de longitud completa fueron ligeramente más altos en ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc D122A que en aquellos tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc, lo que sugiere que la persistencia sérica del propéptido activo aumentó por la mutación D122A (Fig. 5f).

En general, estos resultados indican que la expresión sistémica de GDF11PRO-Fc y GDF11PRO-Fc D122A aumenta la masa muscular esquelética en ratones distróficos mdx y que esta hipertrofia muscular esquelética se asocia con mejoras en la fuerza de agarre y la coordinación motora. Sin embargo, el tratamiento no pareció afectar la resistencia muscular basada en el rendimiento de correr en la cinta de correr. Además, el mutante D122A parecía ser ligeramente más efectivo para aumentar la masa muscular y la función, presumiblemente debido a la persistencia sérica mejorada.

La entrega sistémica del gen GDF11PRO-Fc no reduce la patología distrófica en ratones mdx

Varios estudios han informado que el bloqueo de la señalización de TGF-β-ActRII-SMAD2 / 3, ya sea por inhibición de MSTN o bloqueo de ActRII, puede tener un beneficio terapéutico en modelos animales de DMD . Para determinar el impacto del tratamiento AAV9-GDF11PRO-Fc en la patología distrófica, se realizó un análisis histológico de los músculos de las extremidades y el diafragma.

Los signos característicos de la patología distrófica, incluyendo necrosis muscular, nucleación central, deposición intramuscular de colágeno y presencia de infiltrados inflamatorios fueron evidentes en todos los grupos de mdx (Fig. 6a). En el gastrocnemio, el porcentaje de área fibrótica se redujo en − 39% (p = 0,0273) en ratones tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc. La fibrosis en el gastrocnemio también disminuyó ligeramente en el grupo AAV9-GDF11PRO-Fc D122A; sin embargo, debido a la alta variabilidad interindividual de la fibrosis intramuscular muscular de las extremidades, esta diferencia no alcanzó significación estadística (− 28%; p = 0,1230; Fig. 6b). Tampoco se observaron diferencias significativas en la proporción de miofibras centralmente nucleadas, lo que sugiere que la regeneración de miofibras estaba ocurriendo activamente en todos los grupos (Fig. 6c). La CK sérica, un marcador de la degradación muscular, tampoco se modificó significativamente con el tratamiento (Fig. 6d). Además, el deterioro localizado de la integridad de la membrana de miofibras, medido por tinción inmunofluorescente de IgG anti-ratón, fue evidente en todos los grupos de mdx. Inesperadamente, los ratones mdx tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc D122A mostraron un ligero aumento en el área IgG positiva en promedio, pero esta diferencia no alcanzó significación estadística (+ 55%; p = 0,1729; Fig. 6e y f; Archivo adicional 1: Figura S5). Los signos obvios de necrosis de miofibras, regeneración, nucleación central y penetrancia IgG no fueron evidentes en el gastrocnemio C57BL/10J silvestre, lo que indica que estos marcadores son específicos de la patología distrófica (Fig. 6a-f; Archivo adicional 1: Figura S5).

GDF11PRO-Fc no mitiga la patología distrófica en ratones mdx. ratones mdx de 6 semanas de edad fueron tratados con AAV9-GDF11PRO-Fc (n = 7), AAV9-GDF11PRO-Fc D122A (n = 7) o vehículo (n = 7) mediante inyección en la vena de la cola. También se incluyeron ratones C57BL/10J de la misma edad (n = 5) como control de tipo salvaje. Los ratones fueron sacrificados 12 semanas después del tratamiento. una tinción representativa de HE y MTC de secciones transversales de gastrocnemios de ratones C57BL / 10J y mdx. La nucleación central es evidente en todos los grupos mdx. Las áreas localizadas de necrosis y regeneración de miofibras están marcadas con una flecha negra. El área fibrótica está representada por la región azul en la tinción de MTC. Las barras de escala representan 50 µm en secciones HE y 100 µm en secciones MTC. b Área fibrótica en el gastrocnemio expresada como porcentaje del área total de la sección transversal muscular. c Porcentaje de miofibras que presentan nucleación central. d Medición de los niveles circulantes de CK sérica, un marcador de daño muscular. e Imágenes representativas de inmunofluorescencia de tinción de IgG de ratón (rojo) en secciones transversales de tejido gastrocnemio. La tinción positiva para IgG indica permeabilidad de la miofibra a las proteínas séricas y pérdida de integridad de la membrana. Las secciones se mancharon conjuntamente con WGA para visualizar miofibras individuales. El área ampliada está marcada con una caja blanca. Las miofibras IgG positivas características se representan con una flecha blanca. Las barras de escala representan 100 µm. f El área de miofibras IgG positivas expresada como porcentaje del área total de la sección transversal muscular. g Tinción representativa de HE y MTC de secciones transversales del diafragma de ratones C57BL / 10J y mdx. La patología extensa es evidente en ratones mdx, pero no en ratones C57BL/10J. Las barras de escala representan 100 µm. h Área fibrótica en el diafragma expresada como porcentaje del área total de la sección transversal. *p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; n.s. no significativo; en comparación con los controles mdx tratados con el vehículo

En el diafragma, la tinción H&E reveló necrosis extensa y deposición intramuscular de colágeno en los grupos mdx tratados y no tratados (Fig. 6g). Similar a lo observado en el músculo gastrocnemio, el tratamiento con AAV9-GDF11PRO-Fc o AAV9-GDF11PRO-Fc D122A produjo una leve reducción de la fibrosis intramuscular del diafragma en general. El porcentaje promedio de área fibrótica en el diafragma se redujo en un 15% (p = 0,0328) y un 17% (p = 0).019) con tratamiento AAV9-GDF11PRO-Fc y AAV9-GDF11PRO-Fc D122A, respectivamente (Fig. 6h). Como era de esperar, estas características patológicas estaban ausentes en gran medida en el diafragma de ratones silvestres C57BL/10J (Fig. 6g y h). A partir de estos datos, determinamos que GDF11PRO-Fc y GDF11PRO-Fc D122A son capaces de inhibir ligeramente la deposición intramuscular de colágeno en los músculos de las extremidades y el diafragma durante un período de 3 meses. Sin embargo, el tratamiento no parece detener el ciclo continuo de degeneración y regeneración muscular en el gastrocnemio o diafragma de ratones adultos mdx.