Robert Neville parece ser el único sobreviviente de una pandemia que ha matado a la mayoría de la población humana y ha convertido al resto en «vampiros» que se ajustan en gran medida a sus estereotipos en la ficción y el folclore: chupan sangre, tienen la piel pálida y son nocturnos, aunque por lo demás no se distinguen de los humanos normales. Ambientada implícitamente en Los Ángeles durante 1976, la novela detalla la vida de Neville en los meses y, finalmente, años después del brote, mientras intenta comprender, investigar y posiblemente curar la enfermedad. Enjambres de vampiros rodean su casa todas las noches y tratan de encontrar formas de entrar, lo que incluye a las hembras exponiéndose a sí mismas y a su vecino vampiro gritando implacablemente para que salga. Neville sobrevive atrincherándose dentro de su casa cada noche; está aún más protegido por los repelentes de vampiros tradicionales de ajo, espejos y crucifijos. Tormentas de polvo semanales devastan la ciudad, y durante el día, cuando los vampiros están inactivos, Neville conduce para buscarlos con el fin de matarlos con estacas de madera (ya que parecen impermeables a las balas de sus armas) y para buscar suministros. El pasado de Neville se revela ocasionalmente a través de flashbacks; la enfermedad reclamó a su hija, cuyo cuerpo el gobierno lo obligó a quemar, así como a su esposa, cuyo cuerpo enterró en secreto pero luego tuvo que matar después de que ella resucitara de entre los muertos como vampiro.

Después de episodios de depresión y alcoholismo, Neville finalmente determina que debe haber algunas razones científicas detrás de los orígenes, comportamientos y aversiones de los vampiros, por lo que se dispone a investigar. Obtiene libros y otros materiales de investigación de una biblioteca y, a través de una investigación gradual, descubre que la raíz de la enfermedad es probablemente una cepa de Bacilo de bacterias capaz de infectar tanto a huéspedes fallecidos como vivos. Sus experimentos con microscopios también revelan que las bacterias son mortalmente sensibles al ajo y la luz solar. Un día, un perro callejero y herido encuentra su camino a su calle, llenando a Neville de asombrada alegría. Desesperado por compañía, Neville se gana minuciosamente la confianza del perro nervioso con la comida y la lleva a casa. A pesar de sus esfuerzos, el perro enfermizo muere una semana después, y Neville, despojado de toda esperanza, resignadamente vuelve a aprender más sobre los vampiros.

Las continuas lecturas y experimentos de Neville sobre vampiros incapacitados le ayudan a crear nuevas teorías. Cree que los vampiros se ven afectados por espejos y cruces debido a la «ceguera histérica», el resultado del condicionamiento psicológico previo de los infectados. Enloquecidos por la enfermedad, los infectados reaccionan ahora como creen que deberían cuando se enfrentan a estos elementos. Incluso entonces, su reacción se limita a las creencias de la persona en particular; por ejemplo, un vampiro cristiano temería a la cruz, pero un vampiro judío no lo haría. Neville, además, descubre medios más eficientes para matar a los vampiros, que no sean simplemente clavarles una estaca en el corazón. Esto incluye exponer a los vampiros a la luz solar directa o infligir heridas amplias y expuestas al oxígeno en cualquier parte de sus cuerpos para que las bacterias pasen de ser simbiontes anaeróbicos a parásitos aeróbicos, consumiendo rápidamente a sus huéspedes cuando se exponen al aire, lo que da la apariencia de que los vampiros se licúan instantáneamente. Sin embargo, las bacterias también producen «pegamento corporal» resistente que sella instantáneamente heridas romas o estrechas, haciendo que los vampiros sean a prueba de balas. Con su nuevo conocimiento, Neville está matando a un número tan grande de vampiros en sus incursiones diarias que sus visitantes nocturnos han disminuido significativamente. Neville cree además que la pandemia se propagó no tanto por mordeduras directas de vampiros, sino por mosquitos portadores de bacterias y tormentas de polvo en las ciudades después de una guerra reciente. La inconsistencia de los resultados de Neville en el manejo de vampiros también lo lleva a darse cuenta de que, de hecho, hay dos tipos de vampiros que reaccionan de manera diferente: aquellos conscientes y que viven con una infección que empeora y aquellos que han muerto pero han sido reanimados por la bacteria (i. e. muerto).

Después de tres años, Neville ve a una mujer aterrorizada a plena luz del día. Neville sospecha inmediatamente después de que retroceda violentamente en presencia de ajo, pero lentamente se ganan la confianza el uno al otro. Finalmente, los dos se consuelan románticamente y él explica algunos de sus hallazgos, incluida su teoría de que desarrolló inmunidad contra la infección después de ser mordido por un murciélago vampiro infectado hace años. Quiere saber si la mujer, llamada Ruth, está infectada o es inmune, prometiendo tratarla si está infectada, y ella a regañadientes le permite tomar una muestra de sangre, pero de repente lo deja inconsciente mientras ve los resultados. Cuando Neville se despierta, descubre una nota de Ruth confesando que ella es de hecho un vampiro enviado a espiarlo y que él era responsable de la muerte de su marido, otro vampiro. La nota sugiere además que solo los vampiros no muertos son patológicamente violentos, pero no aquellos que estaban vivos en el momento de la infección y que aún sobreviven debido a mutaciones casuales en sus bacterias. Estos infectados vivos han superado lentamente su enfermedad y están tratando de construir una nueva sociedad. Han desarrollado medicamentos que disminuyen el peor de sus síntomas. Ruth le advierte a Neville que sus sentimientos por él son verdaderos, pero que su gente intentará capturarlo y que debería intentar escapar de la ciudad.

Sin embargo, asumiendo que será tratado de manera justa por la nueva sociedad, Neville se queda en su casa hasta que los miembros infectados llegan y despachan violentamente a los vampiros no muertos fuera de su casa con una alegría diabólica. Al darse cuenta de que los atacantes infectados pueden tener la intención de matarlo después de todo, les dispara y, a su vez, es disparado y capturado. Herido de muerte, Neville es colocado en una celda con barrotes donde es visitado por Ruth, quien le informa que ella es un miembro senior de la nueva sociedad, pero, a diferencia de los demás, no le molesta. Después de discutir los efectos de las actividades de asesinato de vampiros de Neville en la nueva sociedad, reconoce la necesidad pública de la ejecución de Neville, pero, por piedad, le da un paquete de píldoras suicidas de acción rápida. Neville acepta su destino y le pide a Ruth que no deje que esta sociedad se vuelva demasiado despiadada. Ruth promete intentarlo, lo besa y se va. Neville va a la ventana de su prisión y ve a los infectados mirándolo fijamente con el mismo odio y miedo que una vez sintió por ellos; se da cuenta de que él, un remanente de la vieja humanidad, ahora es una leyenda para la nueva raza nacida de la infección. Reconoce que su deseo de matarlo, después de haber matado a tantos de sus seres queridos, no es algo que pueda condenar. A medida que las píldoras surten efecto, se divierte con la idea de que se convertirá en su nueva superstición y leyenda, al igual que los vampiros lo fueron una vez para los humanos.