La fase móvil

La fase móvil en cromatografía de fase inversa es una mezcla de agua o tampón con un solvente orgánico polar como metanol, acetonitrilo, isopropanol (IPA) o tetrahidrofurano (THF). La fuerza de elución aumenta aproximadamente en este orden. Los alcoholes son donantes de protones, mientras que el acetonitrilo es un aceptor de protones. Las mezclas de acetonitrilo / agua tienen una viscosidad más baja en comparación con las mezclas de otros disolventes con agua. Esto se traduce en una menor contrapresión. Las mezclas IPA / agua tienen la viscosidad más alta. Debido a la menor contrapresión que resulta de la menor viscosidad, los dos modificadores orgánicos de fase móvil más utilizados son el acetonitrilo y el metanol. Además, el acetonitrilo tiene una absorción baja en los rayos UV bajos, mucho menor que los otros solventes.

El agua es el eluyente más débil en cromatografía de fase inversa. La adición de metanol o acetonitrilo reduce la retención. El logaritmo del factor de retención disminuye aproximadamente en proporción con la concentración de solventes orgánicos. Si el analito es una molécula pequeña, como es el caso de la mayoría de los productos farmacéuticos, la retención disminuirá aproximadamente siete veces cuando la concentración de metanol en la fase móvil aumente en aproximadamente un 20%. En muchas circunstancias (por ejemplo, en el desarrollo de métodos), se asume que hay una relación lineal entre el logaritmo del factor de retención y la fracción de volumen del modificador orgánico en la fase móvil. Sin embargo, uno debe considerar esto solo como una buena regla empírica, que no es precisa ni teóricamente justificable.

Debido a las propiedades de solvatación del acetonitrilo en comparación con el metanol, la sustitución de un disolvente por otro a menudo resulta en un cambio en el orden de elución de los analitos (Figura 2). Por lo tanto, esta técnica se utiliza con frecuencia en el desarrollo de métodos. El cambio de un modificador a otro crea cambios de selectividad más significativos que el cambio de la resistencia del disolvente solo (es decir, cambiando simplemente la concentración del disolvente orgánico). THF también cambia drásticamente la selectividad. En realidad, los mayores cambios de selectividad a menudo son causados por la sustitución de algo de metanol o acetonitrilo por THF. Sin embargo, por varias razones, como su olor desagradable, la formación de peróxidos y la transparencia UV desfavorable, no se usa muy a menudo.

la Figura 2. Influencia del modificador de fase móvil en la selectividad de la separación. Arriba, acetonitrilo; abajo, metanol. Columna: XTerra RP18, 4,6 mm×50 mm, 3,5 µm. Gradiente a 2 ml min-1 durante 15 min de 0 a 80% orgánico a pH 3 con formiato de amonio. Analitos: 1, triamtereno; 2, clortalidona; 3, althiazida; 4, furosemida; 5, benztiazida; 6, probenecid; 7, ácido etacrínico; 8, bumetanida; 9, ácido canrenoico. (Cromatograma proporcionado por Diane Diehl y Kim Tran, Waters Corporation.)

La interpretación de la selectividad del disolvente se complica por el hecho de que el disolvente orgánico es adsorbido por los ligandos de fase estacionaria y puede considerarse parte de la fase estacionaria. Recientemente, varios autores han medido el exceso de superficie de los modificadores orgánicos para las fases estacionarias estándar del tipo C18 y han encontrado diferencias significativas en la solvatación de la superficie entre el acetonitrilo y el metanol.

Se mencionó al principio de esta sección que el metanol proporciona una retención más alta que el acetonitrilo. Esto es aún más pronunciado para los compuestos ionizados que para los compuestos no ionizados. Esto tiene sentido desde el punto de vista de que el metanol adsorbido en la fase estacionaria facilita la penetración de las moléculas ionizadas en la fase estacionaria. El mismo patrón se encuentra cuando se compara el metanol con el THF. Estas son características útiles en el desarrollo de métodos. Por otro lado, los compuestos con grupos funcionales de sulfonamida muestran relativamente más retención en THF, en comparación con un grupo de analitos de referencia. En general, se puede observar una influencia significativa del solvente orgánico en la selectividad de una separación, pero una racionalización es difícil, ya que el solvente se puede encontrar tanto en la fase estacionaria como en la móvil. Algunos autores también han intentado distinguir las fases móviles de alto contenido de agua de las de bajo contenido de agua.

Como se mencionó anteriormente, las importantes diferencias de selectividad entre los diferentes disolventes son una herramienta muy útil en el desarrollo de separaciones de fase inversa. Los esquemas de desarrollo de métodos clásicos han utilizado metanol, acetonitrilo y THF como modificadores orgánicos en la fase móvil. Se pueden obtener selectividades intermedias con mezclas de disolventes, y se puede realizar un ajuste del espaciado de picos sin dificultad. Los esquemas de desarrollo de métodos modernos utilizan la temperatura como otra variable fácilmente controlable en el ajuste de la selectividad.

Un aspecto importante de la selectividad de fase móvil es su pH. El control de la retención de compuestos ionizables con la ayuda de tampones o aditivos ácidos o bases a la fase móvil es muy importante. Al elegir juiciosamente el pH de fase móvil, se puede facilitar la manipulación de la retención y la selectividad. Como se mencionó anteriormente, la diferencia en la retención entre la forma ionizada y la no ionizada de un analito puede ser de 10 a 30 veces, y el control del pH es importante.

En los últimos años, la investigación ha demostrado que tanto el pH como las constantes de ionización del tampón se alteran cuando se le agregan disolventes orgánicos. Esto tiene consecuencias importantes para el control de la retención. Por lo general, se puede llegar a una ionización definida del analito si el pH de la fase móvil está a ±2 unidades de pH del pKa del analito. Pero si el pH y el analito pKa están cambiando con la adición de solvente orgánico, no es fácil lidiar con esto usando reglas simples. Por lo tanto, un buen control del pH y un buen tampón son elementos importantes de la reproducibilidad de una separación de fase inversa de analitos ionizables. El pH se mide en agua, donde uno está familiarizado con los valores de pKa de los tampones de uso común, y prefiere mantenerse cerca de estos valores de pKa. La capacidad máxima del búfer se encuentra en el pKa del búfer. Mientras que el pH cambia en presencia del disolvente orgánico, la capacidad tampón no lo hace. Para el profesional de la cromatografía de fase inversa, este es un aspecto importante del control de retención. Por otro lado, el investigador de mecanismos de retención de fase inversa necesita estar preparado para medir el pH en presencia del disolvente orgánico para comprender completamente su influencia en la retención. Típicamente, la adición del solvente orgánico resulta en un aumento en el pKa de los ácidos y en una disminución en el pKa de las bases. Esto se aplica tanto a los buffers y los analitos. Esto puede resultar en un cambio significativo en el patrón de ionización esperado de un analito. Aquí hay un ejemplo que ilustra esto: una amina con un pKa de 9 está completamente ionizada en un tampón de fosfato a pH 7 en agua, pero solo puede estar medio ionizada en el mismo tampón después de la adición de metanol al 70%. Es evidente que esos efectos son significativos. Por lo tanto, una forma precisa de preparar un tampón y controlar su pH es vital para un buen control de la retención de fase inversa de analitos ionizables.

Otras interacciones iónicas también afectan la retención y la selectividad de una separación de fase inversa de analitos ionizados. Una herramienta clásica para aumentar la retención de analitos iónicos es la cromatografía de pares iónicos. En esta técnica, la fase estacionaria se equilibra con un ion cargado hidrofóbico, como un ion ácido sulfónico de cadena larga (por ejemplo, octilsulfonato) o una amina cuaternaria hidrofóbica (por ejemplo, el ion tetrabutilamonio). Una concentración típica de fase móvil es de alrededor de 10 mm. La adición del reactivo de par de iones a la fase móvil aumenta la retención de iones objetivo, disminuye la retención de iones de la misma carga que el reactivo de par de iones y deja la retención de analitos neutros, incluidos los zwitteriones, casi inalterada. Por lo tanto, es una excelente herramienta para ajustar la selectividad de una separación. La razón de estos cambios en la selectividad es el hecho de que el reactivo de par iónico se adsorbe en la superficie de la fase estacionaria. La interpretación más simple del mecanismo de retención resultante es una combinación de intercambio iónico con el mecanismo de fase inversa. A medida que aumenta la concentración del reactivo de par iónico en la fase móvil, la retención de analitos con carga opuesta aumenta inicialmente, y luego se nivela a concentraciones más altas. Para reactivos de pares iónicos con diferente longitud de cadena, la retención aumenta más rápidamente con una longitud de cadena más larga.

Otro efecto de interacción iónica que se encuentra con los analitos catiónicos es el aumento de la retención cuando se agregan pequeños contra iones inorgánicos a la fase móvil. Las concentraciones requeridas suelen ser 10 veces más altas que las concentraciones utilizadas con reactivos de pares iónicos. Los aniones típicos de este tipo son perclorato (ClO4−), tetrafluoroborato (BF4−) o hexafluorofosfato (PF6−). Aumentan significativamente la retención de analitos catiónicos. El efecto es más pronunciado con el acetonitrilo como aditivo de fase móvil que con el metanol. Esto se explica por una capa más gruesa de acetonitrilo adsorbido en la fase estacionaria en comparación con una capa monomolecular de metanol, y la partición del contador de iones en esta capa. Desde el punto de vista de los usuarios, el comportamiento de retención de analitos catiónicos en presencia de estos aniones inorgánicos no es diferente al observado con reactivos de pares de iones verdaderos, es decir, con ácidos sulfónicos de cadena larga.