Material vegetal

Se realizaron observaciones y análisis químicos de 2011 a 2018 en una colección de plantas cultivadas en el jardín experimental del campus universitario de Lovaina-la-Neuve (50°39’55″N; 4°37’11″E). Antes y durante su período de floración (julio–agosto), las plantas se colocaron en las cámaras de crecimiento de la Universidad en condiciones controladas (24/22 °C; 16 L:8D, HR 80 ± 10%).

Material de insectos

Las principales especies de insectos visitantes de A. napellus (A. mellifera, B. pascuorum y B. terrestris) se utilizaron en ensayos de atractivo floral y preferencia gustativa. Los individuos de A. mellifera y B. pascuorum (10 por prueba y tratamiento) se recolectaron en la naturaleza alrededor del campus universitario (mínimo de cuatro ubicaciones por especie) por la mañana antes de las pruebas. Como B. los individuos de terrestris no se pueden distinguir fácilmente en el campo (morfología similar para varias especies), utilizamos abejorros de cuatro colmenas (Biobest, Westerloo, Bélgica) ubicadas en las proximidades de los edificios de la universidad para obtener individuos para la experimentación.

Rasgos florales

Recuento de polen

Las anteras de 10 flores en las fases masculina y femenina se recolectaron, contaron, secaron y colocaron en un tamiz (90 µm) para frotar para recolectar granos de polen. Se pesó la cantidad de granos de polen. Se realizaron recuentos de polen en la Universidad Lille-1 (Unidad Evo-Eco-Paleo). Usamos un contador de partículas para estimar el número de granos de polen en estas muestras. El día anterior al recuento de polen, las muestras se colocaron en un calentador de tubo hasta que la mayor parte del etanol se evaporó. Luego forzamos la dehiscencia de la antera colocando muestras en un horno a 56 °C durante la noche. Añadimos 1 mL de agua destilada a cada muestra de polen. Los tubos se sonicaron y se vortearon para separar los granos de polen de las anteras y entre sí. La solución de polen (200 µL) se diluyó en 5 mL de tampón de medición isotónica (tonelada CASY®). El contador de partículas analizó tres muestras de 400 µL de la suspensión de polen, proporcionando un recuento total de partículas en este volumen de 1200 µL, así como recuentos para 400 clases de tamaño que van de 0,125 a 150 µm. Las comparaciones con muestras en blanco nos permitieron identificar picos de partículas, con tamaños que oscilan entre 20 y 30 µm, que corresponden a granos de polen. El número de granos de polen por antera se estimó multiplicando los valores proporcionados por el contador de partículas por la relación de dilución (p. ej. (1000/200) × (5000 + 200)/1200).

Color y morfología de las flores

Medimos rasgos florales (longitud de la corola, diámetro de la corola, color floral y reflectancia UV) en 10 flores por fase (de 10 individuos diferentes). El ancho del casco, la longitud de la corola y el diámetro se midieron con una pinza. Medimos el espectro de reflectancia de color tepal utilizando un espectrómetro de fibra óptica (Avaspec-ULS2048) y una fuente de luz pulsada de xenón (AvaLight-XE, Avantes, Apeldoorn, Países Bajos). Para mediciones de reflectancia UV, las flores se fijaron sobre un fondo negro y se fotografiaron con una Nikon D40 (Óptica costera de 60 mm 1:4 ApoMacro UV-VIS-IR; Filtro X-Nite 330).

Colección floral volátil

Muestreamos compuestos orgánicos volátiles (CoV) de flores intactas de fase masculina y femenina (N = 4 para cada fase). Cada flor se insertó individualmente en un bulbo de vidrio (de 50 mm de longitud y 30 mm de diámetro), con una abertura de 17 mm de diámetro. Para evitar la contaminación del aire, se conectó un tubo de teflón lleno de carbón activo a un extremo de la bombilla de vidrio y dos tubos Tenax TA de vidrio (6 mm × 4 mm, 7 pulgadas; malla 60-80, Gerstel, Sigma-Aldrich, Overijse, Bélgica) al otro extremo. Los tubos Tenax se conectaron a bombas de aire calibradas (Gilair plus, Sensidyn, San Petersburgo, EE.UU.) a un caudal de 50 mL·min−1 durante 180 min (entre las 11:00 y las 14:00 h). Las condiciones de laboratorio oscilaron entre 21,5 y 23,5 °C con 45 a 55% de HR.

Los COV atrapados se desorbían térmicamente en un cromatógrafo de gases Agilent 6800 equipado con una unidad de termodesorción Gerstel TDU y criocooler CIS mantenido a -50 °C. Inmediatamente después de la termodesorción, la unidad CIS T° se programó de -50 °C a 300 °C a 12 °C seg−1. El aparato GLC fue acoplado a un espectrómetro de masas Agilent 7975 C. Las condiciones analíticas fueron las siguientes: inyección en modo dividido (con relación de división de 50: 1, helio a 1,6 mL min−1 como gas portador), columna VF-Max MS de 30 m x 250 µm (df = 0,25 µm) (Agilente). El programa de temperatura que permitía la mejor separación (pruebas preliminares no mostradas) se fijó de la siguiente manera: 40 °C (5 min), luego a 75 °C a 4 °C min−1 y a 115 °C (3 °C min−1) y finalmente a 250 °C a 13 °C min−1. Las condiciones de EM fueron las siguientes: Modo EI a 70 eV, T ° fuente = 250 ° C, cuadrupolo MS a 200 ° C y rango de masa escaneada de 35 a 500 amu.

Los cromatogramas grabados se interpretaron sistemáticamente para buscar COV específicos de las fases masculina o femenina. Cuando se detectaron, las moléculas se identificaron de acuerdo con bases de datos computarizadas (Wiley 250.L y PAL 600). Las identificaciones se corroboraron con base en los datos de retención de moléculas puras disponibles comercialmente. También se cuantificaron en relación con el patrón interno de alta pureza (limoneno, solución de metanol de 1 µL a 0).67 µg µL1 añadidos automáticamente a cada tubo de desorción antes del proceso térmico).

El aire ambiente también se recogió como control para identificar contaminantes de fondo. Para evitar un posible avance, se colocó sistemáticamente en tándem un segundo cartucho de vidrio cargado con el mismo adsorbente (Tenax TA). El análisis no reveló ningún rastro de las moléculas de interés.

Recolección y análisis de alcaloides

Se recolectaron anteras de 50 flores (de 10 individuos), se secaron y luego se trituraron en un tamiz (90 µm) para recolectar granos de polen. Se tomaron muestras de alcaloides en tres réplicas de 15 mg de polen. Las muestras se congelaron (-80 °C) durante 2 h y luego se liofilizaron. Las muestras secas se molieron hasta obtener un polvo fino con nitrógeno líquido y se colocaron cantidades pesadas de polvo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Los alcaloides se extrajeron utilizando un homogeneizador de tejidos (limpiador ultrasónico VWR) durante 10 minutos en 100 µL de tampón de extracción (metanol acuoso al 70% y ácido fórmico al 0,5%). Después de la centrifugación a 12.000 rpm durante 5 min (Centrifugadora 5430 R), el sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Después del secado en un SpeedVac, los alcaloides se resuspendieron en 200 µL de metanol de grado LC-MS y se filtraron con un filtro de jeringa de PTFE de 0,45 µm (Whatman).

El néctar se recolectó en tubos capilares de vidrio de 5 µL (Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Alemania) de 50 flores (de 10 individuos). Se secaron tres réplicas de 15 µL de néctar en un SpeedVac y se resuspendieron en 200 µL de metanol de grado LC-MS antes de la filtración con un filtro de jeringa de PTFE de 0,45 µm (Whatman).

Los análisis químicos se realizaron utilizando un sistema LC-MS/MS consistente en una bomba Thermo Accela, un muestreador automático, un detector de matriz de fotodiodos y un detector de masa Thermo Scientific LTQ orbitrap XL (MASSMET, Instituto de Investigación de Medicamentos de Lovaina, Woluwe, Bélgica). Se utilizó una columna Phenomenex Gemini C18 (2 mm × 150 mm, embalada con partículas de 3 µm). Se utilizó un sistema binario de solventes con un caudal de 300 µL min-1: solvente A, agua de grado HPLC (0,1% de ácido fórmico); y solvente B, metanol de grado LC-MS (0 min: 95% A, 10-12 min: 0% A, 13-17 min: 95% A). Se inyectó un volumen de 10 µL y la temperatura de la columna se fijó en 30 °C. Se realizó EM de alta resolución con una fuente de ionización electrospray en modo positivo. Se aplicaron las siguientes condiciones de entrada: temperatura capilar, 275 °C; tensión capilar, 13 V; lente de tubo, 140 V; flujo de gas de vaina, 30 u.a.; y flujo de gas auxiliar, 10 u.a. La adquisición y procesamiento de datos se realizaron con el software Xcalibur. Este método cubrió el rango de masa de todos los alcaloides (MW de 329 a 673). Los alcaloides del polen y el néctar se detectaron e identificaron provisionalmente mediante EM de alta resolución. La fragmentación obtenida por disociación inducida por colisión ayudó en la identificación. Las concentraciones de alcaloides se calcularon en base a una curva estándar de aconitina en MeOH y se expresaron como «equivalente de aconitina». Los alcaloides analizados se seleccionaron en función de su presencia en otras especies de acónitos4,8.

Producción de néctar y composición del azúcar

El néctar se recolectó en tubos capilares de vidrio de 5 µL (Laboratorio Hirschmann, Eberstadt, Alemania) de flores de las plantas transferidas en las cámaras de crecimiento del campus universitario (sin visitas de insectos). Se estimó la tendencia de producción de néctar durante el día al inicio de la antesis mediante muestreo de 2 flores de 12 individuos cada 2 horas durante 10 horas. También medimos la producción total de néctar por flor (2 flores de 12 individuos) para las mismas flores cada 2 días durante toda la vida de la flor (9 días), a la misma hora cada día, 2 horas después de que se encendiera la luz. La producción total para las fases masculina y femenina se estimó a partir del muestreo al final de las fases masculina (5 días después de la antesis) y femenina (8 días).

Las muestras de néctar se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron los análisis químicos. Después de la derivación, se realizó la identificación y cuantificación del azúcar mediante GC-MS (Thermo Trace 1310 /Thermo ISQ-QD). Se utilizó una columna Restek Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 µm df). El caudal fue de 1,0 mL min−1 (helio). Las proporciones de división inyectadas fueron de 1/10 para las hexosas y de 1/100 para la sacarosa. Se aplicaron las siguientes condiciones de entrada: temperatura del horno, 105 °C durante 4 min, luego a 280 °C a 15 °C min-1 (durante 20 min) y temperatura del inyector de 250 °C.El contenido total de azúcar de néctar por flor (mg) se calculó entonces como volumen de néctar (µL) x concentración total de azúcar (mg/µL).

Comportamiento de los insectos

En 2011 y 2012, se llevaron a cabo investigaciones en las cuatro poblaciones naturales restantes en fens en el sur de Bélgica. De estos, la reserva natural «Les Abattis» (49°40’50″N; 5°32’59″E) contiene la población más grande y densa (2970 m2 con 1330 ± 1030 flores de A. napellus m−2). En «Fouches»(49°4’8″N; 5°43’06» E), que tiene la segunda población más grande (1788 m2), individuos de A. los napelos estaban muy dispersos en el área y en densidades mucho más bajas (176 ± 177 flores m-2)»Chantemelle’ (49°39’37″N; 5°39’37» E)’ tenía una población discontinua que consistía en tres parches (161, 423 y 500 m2) con densidades de plantas y flores relativamente bajas (179 ± 125 flores m−2). «Sainte-Marie»(49°40’06″N; 5°32’56» E) tenía una población pequeña y irregular (292 m2, 152 ± 163 flores m−2) que se extendía unos 150 m a lo largo de una antigua vía férrea.

Se registraron visitantes de flores en observaciones de 10 minutos durante el pico de floración en tres días consecutivos en 2011 (entre el 30 de agosto y el 3 de septiembre) y en cuatro días en 2012 (entre el 21 y el 27 de agosto) con condiciones climáticas secas y cálidas. La proporción de flores en fase masculina, durante estos días y en todas las poblaciones, fue mayor que la de flores en fase femenina (alrededor del 85%). Se observaron flores dentro de 1 m2 (o aproximadamente cinco plantas) al mismo tiempo. Se realizaron un mínimo de diez observaciones por población (máximo 16), repartidas en todas las poblaciones y en diferentes momentos del día. Para cada visitante, registramos la especie, el número de flores robadas y no robadas visitadas por planta y parche, el tiempo dedicado por flor individual, así como su comportamiento de forrajeo (recolección de polen o néctar, visita legítima o ilegítima, conocida como robo (robo de base, robo primario y secundario). Durante 530 min de observaciones de flores en 2011 y 400 min en 2012, registramos 183 visitantes de flores. Los abejorros (B. pascuorum y B. hortorum) y las abejas melíferas (Apis mellifera) fueron los principales visitantes de las flores; solo se observaron 3 individuos de B. terrestris.

Capacidad de carga de polen

Treinta individuos por especie fueron matados con acetato de etilo y almacenados individualmente. El polen se eliminó de las diferentes partes del cuerpo de los insectos con pequeños cubos de gelatina-glicerina53. Los granos de polen concentrados en la corbícula se eliminaron y no se incluyeron en los análisis. Todos los granos de polen fueron contados por microscopía de luz.

Pureza de la recolección de polen

Muestreamos cargas de polen de abejorros que visitaban a A. napellus en las poblaciones naturales. En el laboratorio, las cargas de polen fueron acetolizadas53. Al menos 400 granos de polen elegidos al azar de cada una de las 25 cargas de polen se identificaron y contaron bajo microscopía de luz.

Respuestas gustativas de los visitantes de insectos

Se siguió el protocolo de Ma et al.54 para detección de aconitina. Al ser capturadas, las abejas individuales se morían de hambre durante 3 horas en un vial de plástico (7 cm de largo, 2,8 cm de diámetro interior) a temperatura ambiente y en completa oscuridad en el laboratorio. Transferimos cada abeja a un tubo de retención, un tubo centrífugo de 15 mL con un orificio de 4 mm perforado en la punta y un trozo de malla de acero fijado en el interior. Después de una fase de prueba previa con una gota de sacarosa, presentamos la solución de prueba en un tubo capilar de vidrio de 100 µL y apretamos suavemente el tubo para mantener la solución en la punta del tubo. Se eliminó de la prueba cualquier insecto sin extensión de probóscide después de 5 minutos. Las fases de prueba duraron 2 minutos, y el volumen de la solución antes y después de la prueba se registró con un calibrador.

Se realizaron pruebas con tres especies visitantes (A. mellifera, B. pascuorum y B. terrestris). Se probaron diez individuos por especie de insecto con cada solución. Las concentraciones de sacarosa (430 µg mg−1) y aconitina (232 µg g−1) correspondieron a las encontradas en nuestra especie. Se presentaron tres soluciones: agua desionizada sola (control), solución de sacarosa pura y solución de sacarosa más aconitina.

Para todas las pruebas, se calculó un índice de disuasión para cada sujeto a partir de la elección de beber, el volumen de solución consumido y el tiempo de contacto con la solución de la siguiente manera: ID = 1- (elección de sacarosa/elección de sacarosa + aconitina) × (volumen consumido de sacarosa/volumen consumido de sacarosa + aconitina) × (tiempo de contacto con la solución de sacarosa/tiempo de contacto con la solución de sacarosa + aconitina).

Análisis estadísticos

La normalidad de los datos se estimó mediante las pruebas de Shapiro–Wilk y la homocedasticidad se verificó mediante las pruebas de Levene. Cuando se cumplieron los requisitos de normalidad y homocedasticidad, se realizaron análisis de varianza (ANOVAs) (efecto de fase floral en volátiles florales). De lo contrario, se realizaron pruebas no paramétricas utilizando la prueba de Wilcoxon para la comparación de dos condiciones (efecto de la fase floral en la morfología de la flor y los parámetros del néctar) y la prueba de Kruskall-Wallis para la comparación de más de dos condiciones (efecto del insecto y la solución en el volumen consumido y la duración del contacto con la solución en experimentos gustativos, efecto del insecto en el comportamiento de visita) y pruebas de chi cuadrado para comparar los porcentajes de individuos en experimentos gustativos. Los análisis ANOVA y no paramétricos fueron seguidos por la comparación de pares múltiples cuando se compararon más de dos condiciones. Todos los análisis se realizaron en SAS Enterprise Guide 7.1. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar.