Espectros de absorción

El espectro de absorción de tiamina se registró contra el agua (Figura 1), se encontró que la tiamina exhibe un pico de absorción máxima (λ max) a 235 nm. Debido al alto desplazamiento azul de λ max de tiamina, su determinación en la forma de dosificación basada en la medición directa de su absorción para ultravioleta es susceptible a interferencias potenciales de los excipientes comunes. Por lo tanto, la derivatización de la tiamina para obtener especies que absorben el rango visible era indudablemente necesaria. Así, se realizó la derivatización de tiamina con NBD-Cl y se registró el espectro de absorción del producto contra el reactivo en blanco (Figura 1). Se encontró que el producto es de color marrón exhibiendo λmax a 434 nm, y el λmax de NBD-Cl fue de 342 nm. El λmax del derivado de tiamina-NBD-Cl se desplazó al rojo, eliminando cualquier interferencia potencial. Por lo tanto, la longitud de onda de 434 nm se fijó como óptima.

Optimización de las condiciones de reacción

Figura 1: Espectros de absorción de Tiamina (3), NBD-Cl (2) y el complejo entre ellos (1).

Las condiciones óptimas para el método desarrollado se establecieron variando los parámetros uno a la vez, manteniendo los otros parámetros constantes y siguiendo el efecto ejercido sobre la absorbancia del producto coloreado. Para establecer las condiciones experimentales, se investigó el efecto de varios parámetros como el pH, el tiempo, el volumen tampón y la concentración de NBD-Cl.

Efecto del pH

El efecto del pH en la reacción entre tiamina y NBD-Cl se probó variando la forma de pH de 7,0 a 12,0. Como se muestra en la Figura 2, la absorbancia del producto es baja a pH 7,0, lo que indica que la tiamina no puede reaccionar con (NBD-Cl) en medios neutros. Esto se debió posiblemente a la existencia del grupo amino de la tiamina en forma de sal clorhidratada, que dificulta la capacidad de sustitución nucleofílica. A medida que el pH aumentaba de 7 a 12, las lecturas aumentaban dramáticamente, liberando el grupo amino de tiamina y facilitando la sustitución nucleofílica. La absorción máxima se alcanzó con un valor de pH de 10,5. A valores de pH superiores a 10,5, se produjo una disminución de la absorción. Esto se atribuyó probablemente al aumento en la cantidad de ion hidróxido que aumenta la velocidad de reacción hacia atrás de la tiamina con NBD-Cl.

Efecto del tiempo de reacción

La absorbancia del producto de reacción se monitorizó en diferentes momentos (Figura 3). Manteniendo intactas otras condiciones, se siguió la absorbancia del producto de reacción después de permanecer de pie durante diferentes períodos de tiempo a 25°C. Los resultados muestran que la tiamina reacciona con NBD-Cl a 25°C y la absorbancia comienza a aumentar gradualmente y alcanza un máximo después de 25 minutos. Para tiempos de reacción más largos, se observó una ligera caída de la absorbancia. En consecuencia, 25 minutos se estableció como el tiempo de reacción conveniente para la determinación.

el Efecto de la cantidad de buffer

Figura 2: Efecto del pH en la reacción de Tiamina con NBD-Cl.
Tiamina (20 µg / ml) : 1 ml, conc. NBD-Cl. 0,2% (p / v), tiempo de reacción 20 min.

Figura 3: Efecto del tiempo de reacción en la reacción de Tiamina con NBD-Cl.
Tiamina (20 µg / ml): 1 ml, tampón (pH 10.5): 1.5 ml, NBD-Cl conc. 0,2% (p / v).

Manteniendo el pH en 10,5, también se estudió el efecto de la cantidad de solución tampón en la absorbancia del producto de reacción (Figura 4). La figura revela que la absorbancia del producto de reacción aumenta rápidamente con el aumento de la cantidad de solución tampón, y se vuelve máxima cuando la cantidad de solución tampón alcanza 1,5 ml. Por lo tanto, se seleccionó la cantidad de solución tampón de 1,5 ml para garantizar la máxima absorbancia.

Efecto de la concentración de NBD-Cl

El estudio del efecto de las concentraciones de NBD-Cl mostró que la reacción dependía de la concentración del reactivo. La mayor intensidad de absorción se alcanzó con una concentración de NBD-Cl del 0,2% (p/v), y una mayor concentración de NBD-Cl conduce a una disminución de la absorbancia (Figura 5).

De los experimentos de ajuste de parámetros anteriores, las condiciones optimizadas utilizadas para el ensayo fueron: pH 10,5, concentración de NBD-Cl 0,2% (p/v), volumen del tampón 1,5 mL, tiempo de reacción 25 minutos y temperatura 25ºC.

Figura 4: Efecto de la cantidad Tampón (ml) en la reacción de Tiamina con NBD-Cl.
Tiamina (20 µg / ml): 1 ml, pH tampón: 10,5, conc. NBD-Cl. 0,2% (p / v), tiempo de reacción 25 min.

Figura 5: Efecto de NBD-Cl concentración en su reacción con Tiamina.
Tiamina (20 µg / ml): 1 ml, Tampón (pH 10,5): 1,5 ml, tiempo de reacción 25 min.

la Validación del método

El método fue validado por los siguientes parámetros: especificidad, linealidad, precisión, exactitud, límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ) y robustez de acuerdo con las directrices de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH).

Linealidad, límite de detección (LOD) límite de cuantificación (LOQ)

La linealidad se evaluó mediante un análisis de regresión lineal determinado mediante la construcción de siete concentraciones de tiamina, en el rango de 05-35 µg / ml, que se calculó mediante el método de regresión de mínimos cuadrados para calcular la ecuación de calibración y el coeficiente de correlación. Las curvas de calibración se construyeron mediante la representación gráfica de la concentración frente a la absorbancia, utilizando el análisis de regresión lineal. La ecuación de regresión de los resultados fue Un=0.033 x – 0.009 (r2=0.999), donde a es la absorbancia a 434 nm, x es la concentración de tiamina en µg/mL en el rango de 05-35 µg/mL, y r es el coeficiente de correlación (Tabla 1). Se encontró que el rango de concentración lineal es comparable con nuestro método anterior utilizando NQS . El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se determinaron de acuerdo con la siguiente fórmula LOD=3.3×SDa / b, y LOQ=10×SDa/b, SDa es la desviación estándar de la intersección; b es la pendiente según las directrices ICH . Los LOD y LOQ fueron de 0,667 y 2,020 µg / mL, respectivamente (Tabla 1).

Precisión

La precisión del método propuesto se llevó a cabo aplicando 3 concentraciones diferentes 10, 20 y 30 µg/mL de fármaco tiamínico dentro del rango lineal calculado como el porcentaje del fármaco recuperado de las muestras (Tabla 2).

El error relativo (RE) estuvo dentro de 0,24% con la desviación estándar correspondiente dentro de 0,004 para tres determinaciones diferentes (Tabla 3).

Robustez

Mecanismo de reacción: Se ha reportado que NBD-Cl reacciona con el grupo amino de derivados de aminas primarios o secundarios . De manera similar, el grupo amino de tiamina puede actuar como un nucleófilo debido al par solitario de electrones en el átomo de nitrógeno, tendiendo a atacar el centro deficiente de electrones en NBD–Cl (Tabla 4 & Figura 6). Al mismo tiempo, se ha demostrado que la composición del producto es 1:1 de tiamina y NBD-Cl (Figura 7). Por lo tanto, se concluye que el grupo amino de tiamina reacciona con NBD-Cl para formar un aducto marrón. La ecuación de reacción se muestra en la Figura 7.

la Figura 6: The Job’s method plot for the stoichiometry of the reaction of Thiamine with NBD-Cl Vr: Volume of NBD-Cl (7.5×10-4 mol/L), Vt: Volume of Thiamine (7.5×10-4 mol/L), Vr + Vt=10 ml.

La aplicación del método propuesto al análisis de la forma de dosificación de tiamina

Los comprimidos de tiamina se sometieron al análisis propuesto y la afirmación de la etiqueta concuerda bien con nuestro nuevo método, como se muestra en la Tabla 5. El método propuesto tiene la ventaja de estar prácticamente libre de interferencias de excipientes.

Figure 7: Reacción de Tiamina con NBD-Cl mostrando estequiometría 1:1.